western技术大全

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inal sequence and total amino acid position Pierce PVDF Membrane Western, Southern, Northern, and dot blots Pall Life Science BioTrace PVDF Transfer Membrane Nucleic acid and protein transfers. Protein sequencing $149 Invitrogen PVDF Membrane Protein sequencing, immunoblotting ￥ Whatman Westran Clear Signal PVDF Membrane Western blots 作为 PVDF 膜的鼻祖， Millipore 公司的 PVDF 膜 Immobilon系列分为ImmobilonP（ ） , PSQ(), FL(用于荧光显色 )和 Blotting Sandwiches for High Troughput 四种。 ImmobilonP 膜孔径均一，具有极强的吸附能力，染色性能好、抗溶剂能力强和信噪 比高，有助于提高检测灵敏度，而且开放的孔结构容易接近被吸附的蛋白质，并有助于去除背景上没有吸附的探针，可以说是免疫印迹检测理想的印迹膜。 ImmobilonPSQ 转印膜是印迹小分子蛋白质（ 20KDa）的理想选择 ——优良的蛋白质吸附性能，渗漏少。 内表面面积较大，可供蛋白质吸附从而提高蛋白质测序的得率。 由于不含污染性支撑物或表面活性剂，ImmobilonPSQ 层析谱上的背景峰值极小。 ImmobilonFL也是 Millipore 值得骄傲的产品，因为这是第一个专门为荧光显色优化的转移膜。 通过实验证明，这种膜在 Kodak成像系统可以显示仅 7ng的蛋白，听起来不错吧，有兴趣可以试一试。 这几种膜除了一般的 PVDF 膜的优点之外，最大特点就是一个字 ——快。 按照 Millipore 的操作手册， Immobilon可以在保证质量的前提下缩短 WB 时间到 2个小时 ——主要是缩短封闭和洗脱时间。 这可真是个好消息，因为坐在那儿等WB 结果多浪费时间啊。 缩短这个费时而枯燥的过程，早出结果，可以提高实验效率，利于我们分析实验结果，考虑下步对策嘛。 卷膜经济实惠，裁剪剩下的边角料还可以用来做点杂交，而预裁剪的即用膜更适合高通量等等 ―用金钱换时间 ‖的 实验。 再次强调的是，疏水 PVDF 膜在用前必须经过 50%或以上体积比的甲醇或者乙醇溶液处理几分钟，待膜变成半透明后用 MilliQ 水或者纯水漂洗一下，转入电泳缓冲液平衡才能用。 Invitrogen公司的 PVDF 膜也有大家风范：膜是与两张预裁的滤纸同时提供，方便使用；虽然一般而言 ，但 Invitrogen的 膜自有自家优势 ——特别适合于低背景，高敏感度的印迹反应，同样需要在乙醇或者甲醇，或者异丙醇中浸泡 5 分钟就可以用了。 3. 尼龙膜 尼龙膜更多 是用于核酸的转移，也有见于蛋白印迹，比如 dot blot，比较于 NC膜来说，它的优点是结合力强，特结实又柔软且不易卷曲，机械强度大，便于操作，缺点是背景高 ——由于尼龙膜电荷密度高，使得非结合区的封闭比疏水性NC 膜困难，对于灵敏度高的检测方法，背景问题尤为突出（据分子克隆 III 说通过热处理的酪蛋白和 1%聚乙烯吡咯烷酮延长封闭时间可以改善），而且当转移缓冲液中存在有 SDS 时蛋白质就容易从尼龙膜上泄漏（通过甲醛固定可以缓解这一情况）。 另外至今也没有适合尼龙膜上的直接染色方法。 因此在许多情况下实验室人员进行 WB 实验 不选择尼龙膜。 尽管如此，一些产品却能 ―取其精华，去其糟粕 ‖，将尼龙膜一些不利于蛋白印迹的因素缩小或者去除，使其成为有效的蛋白转移介质。 比如说，化学发光底物做得相当出色的 Pierce 公司，其旗下的 Biodyne Aamp。 B Nylon Transfer Membrane就是这样一个产品。 这种分为 A， B 两型的尼龙膜做工精良，孔径大小一致，为了保有尼龙膜高灵敏度的优点和摒弃背景影响大的缺点， Biodyne 采用了合适的signaltonoise 比例来调整，从而达到了 200ug/cm2 的蛋白结合能力，同 时有比大多数尼龙膜甚至比一些 NC 膜都要小的低背景。 除此之外， B 型的 Biodyne 对于一些带负电蛋白是一种理想的转移膜，因为它在 A 型的基础上提高了正电荷集团的浓度。 另外 Biodyne 相对于 NC 膜来说还是一种 ―打不怕，撕不烂，烧不着（ 200℃ 一下） ‖的 ―顽强 ‖的转移膜。 电转移和半干转，以及转膜的一些细节问题 续前：选好了膜，就该考虑如何做转膜了。 经典的转膜方法是电转移，这个 生物通 在前面的 WesternBlot 仪器之选 里面有提到过，因为电转移需要配套垂直电泳槽来进行。 如何做这个 ―海绵 —几层滤纸 —胶 —膜 —几层滤纸 —海绵 ‖的 ―三文治夹心 ‖，在分子克隆上已经有详细的介绍，相信大家都很容易找到。 一些细节： 1. 记得全程手套操作，一则避免手印污染影响结果，二则保护自己（未交联的丙烯酰胺、甲醛等等虽不立即致命但都会 慢慢毒害你的身体，可不要这样白白为科学献身哈） 2. 如果 WB 前没有可参考的资料 ——比如不知道是否有表达，比如抗体少还要摸条件（稀释度），可以用剪膜剩下的边角料来先做几组点杂交摸条件，省点时间省点试剂； 3. 去掉积层胶后，预染的 Marker 可用以识别胶上下方向和膜的正反面（预染 Marker 如果照着说明书用量，有可能在电泳时看不到条带，但转膜时有浓缩效应而且背景白就可以看到了。 如果要电泳能看到就要参考电泳的那个用量，或者多加 1—2 倍的量）；如果目标蛋白小，指示剂也可以指示方向，但是如果蛋白大，指示剂已经跑出去了，就要留 意分清胶上下方向，切个小角是常用的方法。 膜上要做好标记，识别正反面和上下。 剪一个小小角最方便。 膜和滤纸一起裁最好（不过滤纸上下叠多了膜不好剪，硝纤膜容易裂，用利刀 +尺子 +垫厚报纸划比较容易）尽量和胶一样大小，胶用纯水冲洗一下后用电泳缓冲液平衡过再量。 我自己通常剪的时候会故意长宽各比胶少 1mm，保证膜和胶不会碰到对方背后的滤纸就好。 4. 对于特别小的蛋白， tricine SDSPAGE 电泳有助于提高蛋白大小在1KD—20KD 间的分辨率，不用甘氨酸，丙烯酰胺的浓度也不用太高（可参考 2020 年中国生物工程杂志上有一 篇文章（ 有效分离 1kD 小肽的TricineSDSPAGE 方法 ）， 87 年 ）。 5. 转膜前胶要在转移缓冲液里平衡一下防止胶变形，也有助于进一步去掉可能有碍转膜的杂质。 还有人在这一步浸泡帮助蛋白复性，可以直接在胶上检测蛋白活性。 6. 膜漂在水面（或者甲醇 液面）让液体从下通过膜上的孔渗上来以赶走膜内空气，膜彻底浸润后颜色会变深一点，任何白点或者斑都是没有完全浸润的标志，会影响转膜的。 最后浸没入缓冲液里平衡。 甲醇处理 PVDF 不要超过 15 秒。 以后的步骤中不要让膜干涸了，万一不幸发生也用同样处理。 7. 电转移缓冲液通常用 Tris glycine 系统，如果是转膜后有部分样品要蛋白测序，最好用 CAPS 缓冲液，减少甘氨酸对测序的污染。 8. 半干电转移（ SemiDry）用经过缓冲液饱和的滤纸代替传统转移槽，非常节约试剂，而且效果也好。 由于不用 ―泡 ‖在缓冲液中，半干转不单可用均一 缓冲体系，也可以做非均一转移缓冲体系（配方下面有，还可以加 20 % (v/v) 甲醇，据说有助于增加转膜效率和减少胶变形的，但据说也有可能影响抗体识别）。 半干转可以在 30 分钟内完成转膜（每平方厘米电流—，恒流，冷库。 如果电流要求小可以延长到 60—90 分钟，但要防止过热。 如果有那种温度贴，可以贴上参考温度），即使 205KD 这么大的蛋白转膜效率也高达 80%。 各种大小的蛋白的转移效率都 OK。 半干转可以上下层叠 2 块胶 +膜一起转（面积还是按照单个计算），或者并排放（ 2 块胶的面积计算），只要控制好单位 面积的电流强度和时间，防止过热就好了。 Discontinuous blotting buffer to be used: Anode buffer I: 300 mM Tris Anode buffer II: 30 mM Tris Cathode buffer: 25 mM Tris/HCl (pH 9,4) 40 mM 6Aminocapronic acid 9. 10. 有人觉得转膜加 SDS 有助于大分子蛋白转膜，我个人持保留意见，因为SDS 等去垢剂影响硝纤膜和蛋白的结合，反而不好。 11. 如果只做 Western Blot，膜可以用丽春红 S 染色并在脱色前照相，对后面的免疫反应影响不大。 不要用考马斯亮蓝或者氨基黑染色膜以免影响结果。 如果有预染 Marker 需要用针或者笔扎眼记录条带位置，以免后面会洗掉而无法判断结果。 预染 Marker 也有助于判断转膜的效率和情况，如果比目标分子大的 Marker 都已经转过去了，那就 OK 了。 如果有能在Western结果显色的 Marker（比如 生物通 前面特别推荐的 别出心裁 特别好用的蛋白分子量标准 谁可小看 ―蛋白标准 ‖（下） ）就更方便了。 12. 有人说在中性条件下电泳有助于蛋白测序，如果要蛋白测序需 要提前一天倒胶，并说预电泳 6 小时（有还原剂如 Glycolate）后再倒积层胶。 除了要做 HPLC 分析应该用丽春红 S 而不要用考马斯亮蓝或者氨基黑染色，其他的比如测序和或者 PTH 都可以选灵敏度高些的考马斯亮蓝或者氨基黑。 没条件做，参考而已。 13. 转印后的 PVDF 膜在含 20%甲醇溶液中在白透射光照下不用染色也依稀可以看到透明的蛋白条带，有时这种快速的方法可以不用染色识别条带，避免染色膜影响后继实验。 转膜后的封闭注意： 14. 转膜后，膜上其他的空白位置需要用封闭液封闭。 Western的灵敏度某种程度上受限于封闭做的好不好。 脱脂奶是最常用的经济配方（实验太晚了还可以补充一下营养，哈哈），用这种封闭剂由于里面可能有痕量的生物素和碱性磷酸酶，可能造成背景污染而不适合生物素 —亲和素的检测方法（如果用了生物素标记的 Marker 而且结果背景较高，分析结果也有可能是受此影响），脱脂奶也不适合碱性磷酸酶检测（ AP）方法。 如果采用碱性磷酸酶检测系统，封闭剂最好用 6%酪蛋白 +1%聚乙烯吡咯烷酮+10mmol/L EDTA 磷酸缓冲盐加热 65 度 1 小时确保碱性磷酸酶失活（可以加 %叠氮化钠，新鲜最好）。 经济的脱脂奶配方和 AP 兼容得不太好，再加上 HRP 的底物选择范围也更宽，现在 HRP 是越来越普遍的选择。 但是叠氮钠 (NaN3)对辣根过氮化物酶 (HRP)有灭活作用，如果用 HRP 检测系统则封闭液不要加叠氮化钠为好。 切记。 封闭时间和封闭剂的量都要足够。 封闭不完全，后面就全白忙活了。 15. 如果选用 AP 作为显色方法，封闭时就要选择 Tris 缓冲体系，不要用 PBS，因为 PBS 干扰 AP。 再想起什么再补充吧。 下一篇转到显色试剂的选择了。 WB 蛋白印迹在生物化学这一块是常规实验，就像有人说炒菜中境界最高也最难的是蛋炒饭一样，实验中常规实验也是很考验技能的，除了潜心研究原理 、认真揣摩技巧以外，对于新实验试剂的信息把握，勇于尝试新方法也是非常之重要的 ——各大厂家都在不断开发更方便更灵敏的新产品， ―idea 是生产力 ‖嘛，因此 生物通 这里介绍一些能把我们从日常操作中解脱出来，获得 ―升级版 ‖效果 WB产品。 讲完了 Western Blotting 的电泳转移仪器，蛋白分子量标准和转移膜之后，我们最后来探讨一下 WB 的检测系统。 一般的 WB 检测过程中，都会有封闭、一抗、二抗和底物显 色这四道工序要 ―加工 ‖。 我个人觉得底物显色这最后一步是最关键的，也是最有文章可以作的一个部分。 你看，光标记方式就有生物素标记，地高辛标记，各种酶标记等等，酶标的底物又有各种生色底物、化学发光法底物和荧光底物可供选择；就连识别一抗的配体也不一定非要二抗不可，也可以是抗生物素蛋白，链亲和素或者 Protein A 或 G 等，更别说各种试剂盒琳琅满目，叫人好像无从下手。 不过不急， 生物通 帮你作个参考，让你对各种产品 的优点缺点一览无遗，真正成为一个 WB 高手。 另外如果实验室有已经建立的固定的显色方法，那也没关系，有时候不经意浏览到的方法可能就会对你的实验有莫大的帮助 ——这也就达到我们的目的了。 封闭和一抗的选择没有太多的选择余地 ——封闭前面介绍过了；一抗。 现在的抗体产品说明书一般都有注明应用范围的，说明可以用于 WB 的就 OK。 如果没有这些信息可以遵从以下原则：单抗专一性高，但是经过 SDSPAGE 变性胶电泳的蛋白质可能由于原来的识别位点构象发生改变而不被识别，多抗不如单抗专一性高但更容易得到结果。 如果还有多种抗体选 择，那当然是来源于兔或者小鼠抗体为好，因为后继的检测试剂盒一般都是针对兔鼠的居多，因而选择范围更大通用性也更强。 除了无标记的一抗，还有生物素等各种标记一抗。 还听说有用荧光标记的一抗直接检。