盐藻胞外蛋白质的特性分析

盐藻胞外蛋白质的特性分析内容摘要：

第 5 页 共 16 页 四甲基乙二胺（ TEMED） 巯基乙醇 溴酚蓝 蔗糖 国药集团化学试剂有限公司 丙烯酰胺 （ Acr） N, N’亚甲双丙烯酰胺 (Bis) AMRESCO 三羟甲基氨基甲烷（ Tris） 考马斯亮蓝 R250 国药集团化学试剂有限公司 甘氨酸 ProteinMarker Mid Range Bio Basic Inc. 仪器 UV754 紫外可见光光度计 山东高密彩虹分析仪器有限公司 YP2020N 电子天平 上海科学精密有限公司 78— 1 加热磁力搅拌器 常州国华电器有限公司 日立 CR22G 冷冻高速离心机 日本 HITACHI 公司 电热恒温干燥箱 连云港医疗器械设备厂 DYY— 2C 稳流稳压电泳仪 南京 高新技术校园生物技术所 夹心式垂直板电泳槽 北京六一厂 微量注射器 上海安亭微量进样厂 LD52A 低速离心机 北京医用离心机厂 SZ93 自动双重纯水蒸馏器 上海亚荣生化仪器厂 SHZD（Ⅲ ）循环水式真空泵 巩义市英峪予华仪器厂 DYB2 脱色摇床 江苏省兴化市分析仪器厂 PHS— 2F PH 计 上海精密科学仪器有限公司 ZGX— 300C 智能光照培养箱 杭州钱塘江设备有限公司制造 实验 方法 考马斯亮蓝 G250 染色液制备 称取 100mg 考马斯 亮蓝 G250 粉末，溶于 50mL 95％乙醇中，加入 85％（ W／ V）的磷酸 100mL，最后用蒸馏水定容到 1 000mL， 装入试剂瓶中，此溶液在常温下可放置一个月 [7]。 标准蛋白曲线的制作 用电子天平准确称取标准牛血清白蛋白 20mg，放入烧杯中，用蒸馏水溶解后倒入 100mL容量瓶中，并用蒸馏水定容至 100mL 刻度处，即制成标准蛋白溶液，浓度为。 取干净的具塞试管 6 支，按表 3 编号后，加入各种物质。 并绘制 标准蛋白曲线 如图 1 淮海工学院二○○六届毕业设计（论文） 第 6 页 共 16 页 表 3标准曲线溶液配制 管号 对照 1 2 3 4 5 (ml) 0 蒸馏水 (ml) 0 加入的标准蛋白浓度 (mg/ml) 0 染色液 (ml) 3 3 3 3 3 3 A595nm 0 标准蛋白曲线 y = 4 . 7 2 1 4 x0 . 00 . 20 . 40 . 60 . 81 . 00 . 0 0 0 . 0 5 0 . 1 0 0 . 1 5 0 . 2 0 0 . 2 5蛋白质浓度 / m g / m LA595 图 1 标准牛血清白蛋白的吸光度与蛋白质浓度曲线 盐藻胞外蛋白质的获取与含量测定 (1)盐藻生长培养在光照培养箱中进行。 培养温 度白天为 25℃，夜间 20℃。 光照与黑暗的比为 12h： 12h。 白天光照强度 35001x。 培养 15d 后，进行 胞外蛋白质提取。 [9] (2)取六只三角烧瓶里培养的盐藻倒入 1000 mL 的量筒中，量取 1000mL。 (3)将取得的藻液离心（ 4000r/min,20min）。 取的上清液，置入 500 mL 的三角烧瓶中，放入冰箱上层待用。 (4) 将离心取得胞外蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝 G250 定量测蛋白质法 [7]。 取干净的具塞试管 4 支，按表 4 编号后，依次加入各种物质。 （ 5）利用 紫外可见光光度计 在 A595nm 下测得 1， 2， 3 组的吸光值，在标准曲线上找出相应的点，并求出盐藻胞外蛋白质的浓度。 （ 6）从三角烧瓶中取得 200 mL 盐藻上清液，置于烧杯中。 从冰箱中取出预冷 24h 的丙酮，按与盐藻上清液 1： 1 的体积缓慢加入 500mL 到烧杯中，并不断用玻璃棒搅拌。 然后将烧杯置于冰箱下层，沉淀蛋白质 [12]。 （ 7） 2h 后，从冰箱中取出烧杯。 其中的溶液利用冷冻高速离心机离心（ 10000r/min,5min, 4 ℃） ，用 蒸馏水吹洗法 将取得的沉淀置于试管中，在冰箱下层保存待用。 淮海工学院二○○六届毕业设计（论文） 第 7 页 共 16 页 表 4 盐藻胞外蛋白质的含量测定 的溶液配制 管号 对照 1 2 3 蒸馏水 (ml) 0 0 0 蛋白溶液 (ml) 0 染色液 (ml) 3 3 3 3 盐藻胞外蛋白质的 薄板层析与 Rf 值的测定 （ 1）用洗衣粉清洗玻璃板 4 12cm 和 15 cm 各两块，然后用蒸馏水冲洗，晾干待用。 （ 2）电子天平称取 羧甲基纤维素钠，放入 100mL 烧杯中，加入 25mL 蒸馏水，利用加热磁力搅拌器搅拌均匀。 待羧甲基纤维素钠充分溶解后，再加入 14g 硅胶 G 粉，最后加入 25mL 蒸馏水，用玻璃棒搅拌均匀，直至糊状。 （ 3）将糊状硅胶 G 粉注在玻璃板的一端，轻轻左右摇动，再上下摆动，并轻轻敲打左右两端及底部，至上下左右均己均匀后，放在干净、通风的水平工作台上，自然干燥，即制成薄层层析板。 （ 4）将干燥的薄层层析板放入烘箱内 l10℃活化 15min 置于干燥器中保存备用。 注意： 不能单用 硅胶 G 粉做支持物，否则风干后的硅胶板易破碎。 由于后面的电泳实验需要对薄板上分离的蛋白质做定性分析，因此薄板的厚度要做的尽量厚一些，约 ～ 1mm。 （ 5）配制 6M 的 HCL：量取分析纯 ,加蒸馏水定容至 10mL。 （ 6）从冰箱中取得制备的蛋白质沉淀，化冻，溶解。 （ 7）配制样品溶液：从试管中量取 5mL 蛋白质溶液置于另一干净的试管中，依次加入1ml95%的乙醇， 1 滴 6M 的 HCL，晃动均匀。 （ 8）配制层析液：按照正丁醇：冰醋酸：蒸馏水 4： 1： 1 的比例依次向烧杯加入正丁醇 20ml, 冰醋酸 5ml, 蒸馏水 5ml，搅拌均匀，并倒入层析缸中。 （ 9）从干燥器中取出 4 块薄层层析板， 在薄层层析板下端距底边 处用解剖针轻轻划出一条线作为起始线。 用毛细滴管吸取 配制样品溶液 ，轻轻划在起始线上， 待干后再划一道，如此重复 10～ 20 次即可，划线不可太粗，控制在 2mm 左右。 注意：每次所划的样不宜太多，要适宜均匀。 （ 10） 将点样后的薄层板，置于装有展开剂的展层缸中，每只缸装两块薄层板，倾角15 度，严密封口，进行展开。 展开时间为 3h50min 展开距离约达到薄层板的 3/4 时，取出薄层板。 将 薄层板 放在干净、通风的水平工作台上 30min,让其自然干燥。 （ 11） 配 制 ％茚三酮 丙酮溶液：用电子天平称取 水合 茚三酮 ，置于小烧杯中，然后向烧杯中加入 50mL 丙酮，用玻璃棒搅拌均匀。 （ 12）将显色剂茚三 酮置于玻璃喷雾器中，均匀喷在展开后的层析板上。 用吹风机将淮海工学院二○○六届毕业设计（论文） 第 8 页 共 16 页 薄层板吹干后，将薄层板置于 105℃的烘箱中约 20 分钟，薄层板上出现紫红色的斑点。 （ 13）记下紫红色斑点与所 划线的距离记做 X， 层析液前沿 与所 划线的距离记做 Y。 迁移率 Rf=斑点中心与原点之间的距离记 /原点与溶剂前缘之间的距离。 （ 14）用刀片将紫红色的斑点取下，置于试管中，加入 1mL 蒸馏水，摇匀，用离心机离心（ 4000r/min,10min） ,取上清液，保存与 EP 管中，待用。 盐藻胞外蛋白质的 电泳与分子量测定 （ 1）配制 10%（ W/V） SDS 溶液： 用电子天平 称 取 5gSDS 置于烧杯中 ，加重蒸水至 50mL，微热使其溶解，置 于 试剂瓶中， 4℃ 贮存 ，待用。 SDS 在低温易析出结晶，用前微热，使其完全溶解。 （ 2） 配制 1%TEMED（ V/V）： 用移液枪取 1mLTEMED 注入烧杯中 ，加重蒸水至 100mL，搅拌均匀， 置 于 棕色瓶中， 4℃ 贮存 ，待用。 （ 3）配制 10%AP（ W/V）： 用电子天平 称 取 AP1g 置于烧杯中 ，加重蒸水至 10mL，搅拌均匀。 最好临用前配制。 （ 4）配制 样品溶解液：内含 1。