973项目、国家自然科学基金项目申请书_基于核酸适配体的蛋白质研究新技术和新方法

973项目、国家自然科学基金项目申请书_基于核酸适配体的蛋白质研究新技术和新方法内容摘要：

等无标记的蛋白质传感器，通过传感器综合优化，实现蛋白质的高通量、高灵敏、 高选择性检测，并开展癌症早期诊断应用研究。 课题 3 基于核酸适配体的蛋白质分离与富集新技术研究 参加单位： 南京大学，中国医学科学院，湖南大学 负责人：许丹科教授 学术骨干：练鸿振教授，张晓兵教授，余晓冬副教授，王小明副教授 经费比例： 22% 研究目标： 以课题 1筛选的核酸适配体及其分子识别基础研究为依据，建立以微流控学 与微纳米分离为基础的生物亲和分离技术； 建立高容量、自动化、高度重复性的 低丰度蛋白质的高效富集方法以及高丰度蛋白的无偏去除方法；通过泛素化、磷 酸化、糖基化等翻译后修饰基团的核酸适配体，建立相关翻译后修饰蛋白组的选 择性富集方法。 同时，针对癌症早期诊断应用开展蛋白质标志物分离与鉴定技术 研究。 主要研究内容： 1．微纳米载体上核酸适配体负载技术：通过核酸适配体末端的生物素、巯 基、氨基等化学修饰基团，利用微珠表面修饰亲合素、纳米金与羧基，发展对应 的微纳米载体表面核酸适配体的固定技术。 研究微球表面的核酸适配体的修饰密 度，通过理论与实验分析其理论容量。 2. 蛋白质微纳米分离技术：通过负载核酸适配体的微纳米颗粒，建立高丰 度蛋白去除、低丰度蛋白富集的磁分离、离心分离、超滤分离、柱分离等技术。 通过盐浓度、 pH、温度、变性剂等条件的调节，考察核酸适配体吸附蛋白的洗 脱与微珠的再生条件，研究提高蛋白质富集与去除的重现性的方法。 3．蛋白质富集的微流控芯片技术：制备 PDMS的微流控芯片，通过在芯片 上核酸适配体的固定与样品混合物的循环流动进行低丰度的蛋白质富集捕获。 优 化流路尺寸、核酸适配体固定模式，研究流路 与流体控制对富集捕获效率的影响， 实现低丰度蛋白质的高效率、自动化的富集，并开展癌症早期诊断应用研究。 4. 蛋白质翻译后修饰的捕获富集技术：针对蛋白质磷酸化、泛素化、糖基 化等免疫原性很低的翻译后修饰，设计磷酸化氨基酸、泛素与糖分子等靶分子体 系，筛选翻译后修饰基团的核酸适配体，结合微流控学与微纳米分离技术，建立 翻译后修饰蛋白组的捕获与富集方法。 课题 4 重大疾病蛋白质标志物的发现新方法研究 参加单位： 中国医学科学院，苏州大学，中国科学院化学研究所 负责人：马洁研究员 学术 骨干：宋咏梅副研究员，王成锋主任医师，刘祥军副研究员，彭睿副教授 经费比例： 27% 研究目标： 以课题 3的核酸适配体筛选及蛋白质分离与检测新方法为依据，筛选 针对肝癌、食管癌的特异性核酸适配体分子，建立基于核酸适配体的肝癌、食管 癌蛋白质标志物发现与甄别技术；同时，针对癌症早期诊断应用，建立用于肿瘤 早期诊断和分型诊断的核酸适配体分子识别图谱，并为恶性肿瘤发生发展机制的 研究提供新技术。 主要研究内容： 1. 不同来源肿瘤样本特异性核酸适配体图谱筛选：以食管癌、肝癌为例， 利用细胞、组织等复合靶标以及相应的对照样品，筛选肿瘤特异性的核酸适配体 分子。 2．蛋白质标志物的发现与验证：通过与病变体系特征的蛋白质标志物对应 的核酸适配体分离与富集蛋白质标志物，并利用质谱与核磁谱技术鉴定相关的蛋 白标志物。 同时，利用基于核酸适配体的分子成像技术与流式细胞技术，开展标 志物验证研究。 3. 食管癌、肝癌的早期诊断和分型诊断：对大量早期食管癌、肝癌患者、 健康对照人群血清样本检测，结合临床病历资料，探讨特异性核酸适配体作为恶 性肿瘤早期诊断指标的价值。 利用不同亚型和分 期的食管癌、肝癌病理标本检测 核酸适配体分子识别图谱在肿瘤分型诊断中的临床意义。 将适用于分型诊断的核 酸适配体用于血清样本的检测，评估其在早期恶性肿瘤患者分型诊断中的意义。 4. 肿瘤发生发展的机制研究：以裸鼠为宿主，建立食管癌、肝癌裸鼠移植 瘤模型，将癌细胞悬液皮下种植于裸鼠背部，待肿瘤生长一定体积后用于实验。 利用活体成像方法考察所发展的核酸适配体探针对裸鼠接种成瘤后癌细胞的识 别能力，通过在体、解剖和离体研究手段，考察肿瘤在裸鼠体内各脏器的分布及 其随时间的变化情况，揭示肿瘤发生发展的分 子机制。 研究内容 预期目标 第 一 年 系 列 DNA 或 RNA 文库的合成；针 对肝癌、食道癌相关蛋白的核酸适配 体的初步筛选；肝癌食道癌细胞系、 组织样品以及反筛选样品的制备。 针 对肝癌、食道癌细胞的核酸适配体初 步筛选。 以核酸适配体的 分子识别效应与 构象变化效应为基础，结合纳米生物 技术，研究核酸适配体的非共价标记 技术。 探索基于各类集聚效应的信号 传导新技术。 开展适配体在微纳分离材料表面 组装性质的研究，发展对应的微纳米 载体表面核酸适配体的固定技术，开 展适配体核酸碱基及分子结构的改 造研究，系统研究多种固定载体与适 配体仿生界面制备的规律；开展磁性 微纳颗粒分离技术和新型适配体负 载微纳米粒子材料的研究。 发展通过细胞或组织筛选进行高 通量的蛋白质标志物发现的新方法 设计与合成 5 个 DNA 或 RNA 文 库；初步富集到可识 别肝癌、食道癌 相关蛋白的核酸适配体库一个；初步 富集到可识别肝癌、食道癌细胞的核 酸适配库 2 个。 构建基于非共价标记的核酸适配体 分子探针。 实现适配体在微纳材料表面的高效 结合，为适配体仿生识别界面的建立 提供理论指导和有效方法。 建立快 速、高效的磁性分离平台，建立低丰 度蛋白的快速富集与检测技术。 建立基于核酸适配体的蛋白标志物 富集与鉴定方法。 研究内容 预期目标 第 克隆与表征特异性识别肝癌、食道 癌相关蛋白及癌细胞的核酸适配体， 进行结构分析与冗余序列的剪裁，进 行识别机理的 研究；进一步筛选针对 肝癌、食道癌组织和血清样品的核酸 适配体。 获得 23 种特异性识别肝癌、食道癌 相关蛋白核酸适配体；获得 34 种特 异性识别肝癌或食道癌细胞和组织 的核酸适配体。 利用核酸适配体与靶蛋白结合时的 构象互变性质，发展非标记的蛋白质 四、年度计划 研究内容 预期目标 第 一 年 系 列 DNA 或 RNA 文库的合成；针 对肝癌、食道癌相关蛋白的核酸适配 体的初步筛选；肝癌食道癌细胞系、 组织样品以及反筛选样品的制备。 针 对肝癌、食道癌细胞的核酸适配体初 步筛选。 以核酸适配体的 分子识别效应与 构象变化效应为基础，结合纳米生物 技术，研究核酸适配体的非共价标记 技术。 探索基于各类集聚效应的信号 传导新技术。 开展适配体在微纳分离材料表面 组装性质的研究，发展对应的微纳米 载体表面核酸适配体的固定技术，开 展适配体核酸碱基及分子结构的改 造研究，系统研究多种固定载体与适 配体仿生界面制备的规律；开展磁性 微纳颗粒分离技术和新型适配体负 载微纳米粒子材料的研究。 发展通过细胞或组织筛选进行高 通量的蛋白质标志物发现的新方法 设计与合成 5 个 DNA 或 RNA 文 库；初步富集到可识 别肝癌、食道癌 相关蛋白的核酸适配体库一个；初步 富集到可识别肝癌、食道癌细胞的核 酸适配库 2 个。 构建基于非共价标记的核酸适配体 分子探针。 实现适配体在微纳材料表面的高效 结合，为适配体仿生识别界面的建立 提供理论指导和有效方法。 建立快 速、高效的磁性分离平台，建立低丰 度蛋白的快速富集与检测技术。 建立基于核酸适配体的蛋白标志物 富集与鉴定方法。 研究内容 预期目标 第 克隆与表征特异性识别肝癌、食道 癌相关蛋白及癌细胞的核酸适配体， 进行结构分析与冗余序列的剪裁，进 行识别机理的 研究；进一步筛选针对 肝癌、食道癌组织和血清样品的核酸 适配体。 进一步发展以纳米材料为依托的非 标记核酸适配体传感技术，以小分子 探针的集聚效应等为基础，发展基于 获得 23 种特异性识别肝癌、食道癌 相关蛋白核酸适配体；获得 34 种特 异性识别肝癌或食道癌细胞和组织 的核酸适配体。 利用核酸适配体与靶蛋白结合时的 构象互变性质，发展非标记的蛋白质 核酸适配体分析方法。 利用荧光纳米 颗粒等纳米材料具有稳定性好、信号 强度高等优点，构建核酸适配体荧光 研究内容 预期目标 第 一 年 系 列 DNA 或 RNA 文库的合成；针 对肝癌、食道癌相关蛋白的核酸适配 体的初步筛选；肝癌食道癌细胞系、 组织样品以及反筛选样品的制备。 针 对肝癌、食道癌细胞的核酸适配体初 步筛选。 以核酸适配体的 分子识别效应与 构象变化效应为基础，结合纳米生物 技术，研究核酸适配体的非共价标记 技术。 探索基于各类集聚效应的信号 传导新技术。 开展适配体在微纳分离材料表面 组装性质的研究，发展对应的微纳米 载体表面核酸适配体的固定技术，开 展适配体核酸碱基及分子结构的改 造研究，系统研究多种固定载体与适 配体仿生界面制备的规律；开展磁性 微纳颗粒分离技术和新型适配体负 载微纳米粒子材料的研究。 发展通过细胞或组织筛选进行高 通量的蛋白质标志物发现的新方法 设计与合成 5 个 DNA 或 RNA 文 库；初步富集到可识 别肝癌、食道癌 相关蛋白的核酸适配体库一个；初步 富集到可识别肝癌、食道癌细胞的核 酸适配库 2 个。 构建基于非共价标记的核酸适配体 分子探针。 实现适配体在微纳材料表面的高效 结合，为适配体仿生识别界面的建立 提供理论指导和有效方法。 建立快 速、高效的磁性分离平台，建立低丰 度蛋白的快速富集与检测技术。 建立基于核酸适配体的蛋白标志物 富集与鉴定方法。 研究内容 预期目标 第 克隆与表征特异性识别肝癌、食道 癌相关蛋白及癌细胞的核酸适配体， 进行结构分析与冗余序列的剪裁，进 行识别机理的 研究；进一步筛选针对 肝癌、食道癌组织和血清样品的核酸 适配体。 进一步发展以纳米材料为依托的非 标记核酸适配体传感技术，以小分子 探针的集聚效应等为基础，发展基于 获得 23 种特异性识别肝癌、食道癌 相关蛋白核酸适配体；获得 34 种特 异性识别肝癌或食道癌细胞和组织 的核酸适配体。 利用核酸适配体与靶蛋白结合时的 构象互变性质，发展非标记的蛋白质 核酸适配体分析方法。 利用荧光纳米 颗粒等纳米材料具有稳定性好、信号 强度高等优点，构建核酸适配体荧光 研究内容 预期目标 第 一 年 系 列 DNA 或 RNA 文库的合成；针 对肝癌、食道癌相关蛋白的核酸适配 体的初步筛选；肝癌食道癌细胞系、 组织样品以及反筛选样品的制备。 针 对肝癌、食道癌细胞的核酸适配体初 步筛选。 以核酸适配体的 分子识别效应与 构象变化效应为基础，结合纳米生物 技术，研究核酸适配体的非共价标记 技术。 探索基于各类集聚效应的信号 传导新技术。 开展适配体在微纳分离材料表面 组装性质的研究，发展对应的微纳米 载体表面核酸适配体的固定技术，开 展适配体核酸碱基及分子结构的改 造研究，系统研究多种固定载体与适 配体仿生界面制备的规律；开展磁性 微纳颗粒分离技术和新型适配体负 载微纳米粒子材料的研究。 发展通过细胞或组织筛选进行高 通量的蛋白质标志物发现的新方法 设计与合成 5 个 DNA 或 RNA 文 库；初步富集到可识 别肝癌、食道癌 相关蛋白的核酸适配体库一个；初步 富集到可识别肝癌、食道癌细胞的核 酸适配库 2 个。 构建基于非共价标记的核酸适配体 分子探针。 实现适配体在微纳材料表面的高效 结合，为适配体仿生识别界面的建立 提供理论指导和有效方法。 建立快 速、高效的磁性分离平台，建立低丰 度蛋白的快速富集与检测技术。 建立基于核酸适配体的蛋白标志物 富集与鉴定方法。 研究内容 预期目标 第 克隆与表征特异性识别肝癌、食道 癌相关蛋白及癌细胞的核酸适配体， 进行结构分析与冗余序列的剪裁，进 行识别机理的 研究；进一步筛选针对 肝癌、食道癌组织和血清样品的核酸 适配体。 进一步发展以纳米材料为依托的非 标记核酸适配体传感技术，以小分子。