毕业论文hiv-1跨膜蛋白gp41核酸疫苗的构建及其免疫原性研究(编辑修改稿)

毕业论文hiv-1跨膜蛋白gp41核酸疫苗的构建及其免疫原性研究(编辑修改稿)内容摘要：

金和人力对艾滋病疫苗以及艾滋病病毒的分子生物学和免疫学进行研究，希望能早日遏止艾滋病在世界范围内尤其是发展中国家不断加速的蔓延趋势。 本研究在前期研究工作的基础上，通过大量的查新， 构建 了表达病毒跨膜 蛋白 gp41 的核酸疫苗，并对其进行了实验性免疫研究，为进一步研究抗 HIV1 病毒的 DNA疫苗提供可借鉴的技术数据。 材料与方法 1 材料 质粒、菌株和细胞 质粒 pIRES， gp41 基因 由军事医学科学院十一所病毒室 保存； 大肠杆菌 DH5a，克隆 载体 的宿主菌 军事医学科学院十一所病毒室 保存； BHK21 细胞系 ， 军事医学科学院十一所病毒室 保存。 工具酶和主要试剂 内切酶 EcoR I 购自大连宝生物工程公司； T4 DNA ligase、 Klenow 大片段、 Ex Taq 酶、 LA Taq DNA 聚合酶、 RNase， CytoTox 96174。 NonRadioactive Cytotoxicity Assay kit 购自 Promega 公司产品； TRIZOL LS Reagent， Invitrogen 公司产品； FITC（异硫氰酸荧光素）标记的羊抗 人 IgG 购自 Promega 公司； DNA Marker、琼脂糖、胰蛋白胨、酵母提取物 、 DNA 回收试剂盒、乙二胺四乙酸 （ EDTA） 、十二烷基磺酸钠 （ SDS） 、溴化乙锭 （ EB） 、 PEG8000、 NaOH、 NaCl、 CaCl LiCl、 琼脂糖、胰蛋白胨、酵母抽提物等均为 GIBCO、 Invitrogen、 TaKaRa、 Sigma 和华美生物工程公司产品 ； 其它常规生化试剂均为分析纯级。 主要仪器 高速低温离心机， Hermle 公司产品；高速常温离心机， Hermle 公司产品； DNA/RNA测量仪（ DNA/RNA Counter）， Pharmacia 公司产品； PCR 扩增仪（ Gene Amp PCR System 9600），PERKINELMER 公司产品； 70℃ 超低温冰箱， SANYO 公司产品； CO2培养箱， SANYO 公司产品； GIS 凝胶成像系统，上海天能科技有限公司产品；荧光倒置显微镜， Olympus 公司产品；倒置显微镜， Olympus 公司产品； SORVALL174。 ULTRA Pro80 高速冷冻离心机，美国科峻 (Kendro)仪器公司的产品； Universal 16R 高速台式冷冻离心机 (Sigma)； Himac CR21低温高速离心机 (HITACHI)；恒温摇床（武汉科学仪器厂）；高压电泳仪（北京六一仪器 11 厂）； TZK800Z 型紫外可见分光光度计（秦州无线电仪器厂）； SMW3800 微波炉（ Japan）；微量恒温器（上海蒲江分析仪器厂 ）； 酸度计 (Beckerman)。 各种溶液及培养液 （ 1） 10% SDS： SDS 50g，浓盐酸调 pH ，加蒸馏水定容至 500 ml。 （ 2） 1 mol/L Tris： Tris ，加蒸馏水定容至 1000 ml。 （ 3） mol/L EDTA： EDTANa2H 2O ，加蒸馏水约 800 ml，剧烈搅拌，加 NaOH调 pH ，加蒸馏水定容至 1000 ml，高压蒸汽灭菌。 （ 4） TE（ pH ）： 1 mol/L Tris 10 ml， mol/L EDTA 2 ml，调 pH ，加蒸馏水定容至 1000 ml，高压蒸汽灭菌。 （ 5） 50TAE ： Tris ，冰醋酸 ml， mol/L EDTA（ pH ） 50 ml，加蒸馏水定容至 500 ml。 （ 6） 100 mmol/L CaCl2： CaCl26H 2O ， 加蒸馏水定容至 200 ml，高压蒸汽灭菌。 （ 7）溶液Ⅰ ：葡萄糖 ， 1 mol/L TrisHC1 ml， mol/L EDTA 2 ml，调 pH ，加蒸馏水定容至 100 ml，高压蒸汽灭菌 15 min。 （ 8） 溶液Ⅱ ：根据实验需要现用现配，取适量体积 2 mol/L NaOH 与 10% SDS 混合后进行 10倍稀释，使其终浓度分别为 mol/L NaOH 与 1% SDS。 （ 9） 溶液Ⅲ ： KAc ， 冰醋酸 ml，加蒸馏水定容至 100 ml。 （ 10） 10 mg/ml RNase：无 DNase 的胰 RNase 溶于 10 mmol/L TrisCl （ pH ）、 15 mmol/L NaCl，配成 10 mg/ml 的浓度， 100℃ 加热 15 min，冷却至室温，分装 成小份保存于 20℃。 （ 11） LB 培养基（ pH ）： Tryptone 1g， Yeast Extract ， NaCl 1g，调 pH ，加蒸馏水定容至 100 ml，高压蒸汽灭菌 20 min。 制备平板时加入 的琼脂粉。 （ 12） 5 mol/L LiCl： LiClH 2O ，加蒸馏水定容至 100 ml，高压蒸汽灭菌 20 min。 （ 13）碱性磷酸酶缓冲液： 100 mmol/L NaCl， 5mmol/L MgCl2， 100 mmol/L TrisCl pH。 （ 14） MEM原液：称取 MEM 1g 溶于 100 ml 四馏水中，高压灭菌后备用。 （ 15） MEM 完全培养液：取 MEM 原液 100 ml，谷氨酰胺 2 ml，蒽诺沙星 4 ml，小牛血清 5%，用 % NaHCO3 调至培养液呈红色。 （ 16） MEM 维持液：除小牛血清为 2%以外，其余成分与 MEM 完全培养液相同。 （ 17） NBT/BCIP 显色液： 66 ml NBT 溶液（ NBT 溶于 10 ml 70%二甲基甲酰胺溶液中）和 10 ml 碱性磷酸酶缓冲液（ 100 mmol/L NaCl， 5 mmol/L MgCl2， 100 mmol/L TrisCl ）混匀，加入 33 ml BCIP 溶液（ BCIP 溶于 10 ml 100%二甲基甲酰胺液中）， 12 此显色液应在 30 min 内使用。 2 实验方法 基础实验操作方法 感受态细胞的制备 （ 1） DH5α， JM109 菌液（无质粒）用 50%甘油保存于 70℃，取出解冻后，吸取 200μ l 菌液，在 Amp琼脂平板表面涂匀， 37℃培养 12h（过夜）。 （ 2） 用牙签挑取单个菌落，接种于 3ml Amp LB 液体培养基中， 37℃，振荡培养过夜（ 250tpm）。 （ 3） 按 1%接种到 250ml（或 100ml）预冷的 Amp LB 培养液中， 37℃，振荡培养到OD600=（或 ～ 或 ～ ）左右，约 1~2h 即可。 （ 4） 冰浴 30min（或 10min），冷却至 0℃。 （ 5） 5000r/min， 4℃，离心 10min，（ 250 离心管 ， 收集菌体 ）。 （ 6） 菌体悬浮于 体积的预冷 CaClTris HCl 溶液中（注 : 100mmol/L CaCl2，10mmol/L Tris HCl （ ）），冰浴 15min。 4℃， 5000r/min 离心 5~15min。 （ 7） 弃上清，菌体重悬于 2mL 含 15%甘油的 Tris CaCl2液中。 （ 8） 以 100μ l/Eppendorf 管分装， 70℃保存。 质粒的转化 （ 1） 取冻存的感受态菌一支（ 100μ l菌液，冰盒），冰浴 10min（化开即可）。 （ 2） 取适量质粒（质粒＜ 1μ l，连接产物＜ 10μ l， DNA≤ 50ng），加入到 100μ l～ 200μ l感受态菌中，充分混匀 （ ≥ 20:1） ，冰浴 30 min （ or 时间稍长）。 （ 3） 立即 42℃水浴热冲击 90s（勿动试管）。 （ 4） 立即冰浴 10 min。 （ 5） 无菌条件下每管（ Eppendorf 管）加 5体积（ 800～ 1000μ l） 37℃预热的LB 培养液（无 Amp）。 （ 6） 37℃振荡培养 40～ 60 min（时间不宜过长，转速不宜过高，主要作用使细菌复苏）。 （ 7） 4000r/min 离心 1 min，倒掉大部分上清液，将其作为菌液（约 50～ 100μ l）涂于LB（ Amp+）平板上（每 1ml培养液加 1μ L 50μ g/ml Amp，实际操作中加 2体积的） Amp。 （ 8） 37℃培养过夜（ 14～ 16h），获得透明、 粟 粒状单菌落。 质粒的小量制 备 （ 1）用牙签挑取经实验一获得的单个菌落（含质粒），接种到 2～ 5ml LB 培养液中（试管）（每 ml培养液加 1～ 2μ l 50μ g/ml Amp）， 37℃振荡过夜（ 250r/min， 12~16h）。 13 （ 2）分装至 Eppendorf 管中（同时保存少量菌种供以后大提或扩菌用）， 4℃， 120xxr/min， 离心 1 min。 （ 3）收集菌体，弃上清，倒置滤纸上空干。 （ 4）将菌体放于冰盒上，重悬于 100μ l 冰预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡均匀（用震荡器），充分悬浮，不要有沉淀块，冰浴 10min（也可直接下 一步）。 （ 5）加 200μ l的新配制的溶液Ⅱ，盖紧轻轻倒转 3~5 次以混合内容物，不要强烈振荡，绝对混匀后呈半透明胶体状，冰浴 3～ 5min（以完全澄清为度，不宜过久）。 （ 6）加 150μL 冰预冷的溶液Ⅲ，温和震荡 10s 后，冰浴 5~15 min（可延长时间）。 （ 7） 4℃， 10000～ 120xx r/min， 离心 10 min。 （ 8）取上清，用等体积酚抽提 ， 颠倒几次，混匀后 4℃， 120xxr/min，离心 8～ 10 min，取上清移至另一个 Eppendorf 管中。 (此步可省略 ) （ 9）用等体积酚：氯仿、异戊醇（ 25∶ 24∶ 1）抽提， 4℃， 120xxr/min 离心 8～ 10 min，取上清移至另一个 Eppendorf 管中。 （ 10）用等体积酚∶氯仿∶异戊醇（ 25∶ 24∶ 1）再次抽提， 4℃， 120xxr/min，离心 8～10 min，取上清移至另一个 Eppendorf 管中。 （此步可省略） （ 11）用等体积氯仿、异戊醇（ 24∶ 1）抽提， 4℃， 120xxr/min 离心 10min，取上清移至另一个 Eppendorf 管中。 （ 12）加 体积的 3mol/L 醋酸钠，用 2体积的冷无水乙醇沉淀质粒 DNA， 20℃放置 2h或更长 时间， 4℃， 120xxr/min，离心 10～ 15 min。 （有资料表明在 20℃沉淀会有较多盐析出，建议在室温放置 2min 沉淀 DNA） （ 13）弃上清，加入 70%（ 4℃）乙醇振荡漂洗沉淀，彻底去上清，用消毒后的滤纸条小心吸净管壁上的乙醇水珠（残留后会对后续工作中使用的酶产生一定的影响），将管倒置放在滤纸上，室温下蒸发痕量乙醇 10～ 15min（实际操作中可置于 37℃温箱中30min）。 （ 14）加入 20～ 25μ lRTE（ ）（含无 DNA 的 RNA 酶 20μ g/ml 的 TE 溶液），溶解 DNA， 37℃水浴 1h 后可进行内切酶酶切实验或－ 20℃贮存（对于目的质粒可用于再转化感受态） 质粒的大量制备 （ 1）用牙签挑取单个菌落接种于 2～ 5ml（ Amp+） LB培养基中， 37℃振荡（ 220r/min）培养 12h左右（或过夜）。 （此步应设无菌对照，同时可取少量作为菌种保存） （ 2）以 1%接种于 200ml 高压 LB 培养液中， 37℃振荡培养 12～ 18h， OD600＝ 左右时（约 12h），倒入 250ml 离心管中，置冰上 10 min（此步亦可留取菌液作种用）。 14 （ 3） 7000r/min， 4℃ ， 离心 15min。 （ 4）弃上清，倒置于滤纸上 空 干。 （ 5）放于冰盒中，重悬于 5ml 溶液Ⅰ（冰预冷），振荡悬浮，不要有沉淀块。 （ 6）加溶液Ⅱ 10ml（ 5mL 2%SDS+5mL NaOH） 混匀 5～ 7次，可以轻轻转动管，动作要慢、轻，使之粘稠、半透明胶体状，冰浴（或室温） 5 min（可以缩短，切忌延长）。 （ 7）加 溶液Ⅲ，上下颠倒混匀，同上步操作，此步绝对避免强烈振荡。 全部形成白色小块状，要彻底。 冰浴 15min，形成白色絮状沉淀，此时可见溶液清亮。 （溶液Ⅰ∶Ⅱ∶Ⅲ =1∶ 2∶ ） （ 8） 4℃， 7000 r/min，离心 10～ 15min。 （ 9）将上清倒入 50 ml 离心管中，加 体积的（或等体积）异丙醇沉淀 DNA，室温30min 以上或 4℃过夜。 （ 10） 9000~10000 r/min， 室温离心 15min。 （ 4℃离心将导致大部分盐析出混入沉淀），小心弃上清。 （ 11）用冷的 70%乙醇 （ 1～ 2ml） 漂洗 1 次， 120xxr/min 离心 2～ 5min，倒掉乙醇，室温干燥或真空抽干。 （此步省略） （ 12）溶于 的 TE（ ）缓冲液中，放置室温，待沉淀周边溶解以后，摇匀使之全部溶解。