抗病毒生防菌f-01菌株发酵条件优化毕业论文(编辑修改稿)

抗病毒生防菌f-01菌株发酵条件优化毕业论文(编辑修改稿)内容摘要：

250mL），由于实验过程中才用碳源十种（ 淀粉，果糖，麦芽糖，甘露糖，半乳糖，葡萄糖，玉米粉，小米粉，大米粉，黄豆 粉）， 氮源五种（ 蛋白胨，大豆蛋白胨，酪蛋白胨，硝酸钾，硫酸铵），在做碳源筛选的时候，分别用所选碳源代替高氏一号中的碳源淀粉；同理，在做氮源的时候，用所选氮源代替高氏一号培养基中的氮源硝酸钾。 用精准天平分别称取高氏一号培养基中所需试剂分量，称取完毕后，分别加入 100ml 的蒸馏水，并将其密封，将培养基放入灭菌框中在立体 式电热压力蒸汽灭菌器 中灭菌 30分钟（ 120℃），灭菌完成后，取出灭菌后的培养基，冷却至室温，在超净工作台里将菌株接种培养基中并密封，将接种的培养基放在摇床（ 28℃， 180rpm）环境下培养 7天， 7天后取出培养基，在超净工作台中，用移液枪从培养基中取菌液于 2ml 离心管中，菌液培养完成。 TMV 病毒液制作：取症状明显感染 TMV 病毒的烟草叶片，并称取其质量，将病毒叶放入研钵中，加入少量的石英砂和 PBS（ Phosphate Buffered Saline ） 进行研磨，研磨大概 30分钟，按照 1g 病毒叶配 100mLpbs 配置病毒液，完成后再加入适量的石英砂（有利于在接种的时候损伤叶片，从而更好的使烟草叶片感染 TMV），完成后将病毒液放入冰箱保存。 PBS（ Phosphate Buffered Saline ）PBS 1L 配方 ：磷酸二氢钾 (KH2PO4)，磷酸氢二钠 (Na2HPO4)，氯化钠 (NaCl)，氯化钾 (KCl)，加水至 1000mL。 ELISA:酶联接免疫吸附剂测定 ( EnzymeLinked Immunosorbnent Assay )： ELISA 是以免疫学反应为基础，将抗原、牽 9体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。 由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行 ，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。 在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。 即 :用于检测抗体的间接法、用于检测抗原的双抗体夹心法以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。 比较常用的是 ELISA 双抗体夹心法及 ELISA 间接法。 检测未知抗原的双抗体夹心法 : 1. 包被：用 1～ 10μ g／ ml。 在每个聚苯乙烯板的反应孔中加 ， 4℃过夜。 次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗 3次，每次 3 分钟。 (简称洗涤，下同 )。 2. 加样：加一定稀释的待检样品 于上述已包被之反应孔中，置 37℃孵育 1小时。 然后洗涤。 (同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔 )。 3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体 (经滴定后的稀释度 )。 37℃孵育 ～ 1小时，洗涤。 4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的 TMB底物溶液 ， 37℃10～ 30 分钟。 5. 终止反应：于各反应孔中加入 2M 硫酸。 6. 结果判定：可于白色背景上， 直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“ +”、“ ”号表示。 也可测 O D值：在 ELISA 检测仪上，于 450nm(若以 ABTS 显色，则 410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔 O D值，若大于规定的阴性对照 OD 值的 倍，即为阳性。 半叶枯斑法： 挑选健康且长势一致的心叶烟， 将事先提取的 TMV病毒液混匀，并取出适量病毒液，采用摩擦接种的方法，将 TMV 病毒液接种到心叶烟的叶片上，由于接种损伤叶片，因此接种后叶片会有短暂的萎焉现象，将其放置34 小时，即待叶片基本恢复正常状态，用毛笔将菌液均匀的涂在接种 TMV 病毒叶片的左半部分，每种菌液设置重复 23 次，菌液涂抹完成，做好标签，涂上菌液后 45 天统计结果，分别统计叶片左右的病斑数，并算出抑制率，可得出菌液的效果，通过活性得较优碳源，氮源组分。 抑制率 =(对照枯斑数一处理枯斑数 )／对照枯斑数 100％ 第二章 培养基优化 菌株优化 菌株培养基：以高氏一号培养基为基础，所选碳源麦芽糖，甘露糖，半乳糖，葡萄糖，果糖代替原培养基中的 2%淀粉，制作培养基，通过高温灭菌，冷 却至常温，并接种 F02菌株； F07 菌株； F12 菌株； FZH菌株四种菌株在摇床（ 28℃， 180rpm）中培养七天。 活性测定：取出各个培养基中的对应菌液，以半叶枯斑法，采用健康，长势基本一样的心叶烟做活性测定。 结果及分析 单糖 重复 2菌株 平均抑制率 % 重复 1 重复 2 左 右 抑制率 % 左 右 抑制率 % 麦芽糖 28 37 24 24 30 20 22 甘露糖 12 21 43 15 26 42 42 半乳糖 14 31 55 10 25 60 57 葡萄糖 29 36 19 16 14 06 12 果 糖 8 19 58 12 27 56 57 单糖 重复 7菌株 平均抑制率 % 重复 1 重复 2 左 右 抑制率 % 左 右 抑制率 % 麦芽糖 7 8 13 8 5 0 13 甘露糖 6 7 14 9 14 36 25 半乳糖 4 15 73 7 9 22 47 葡萄糖 22 31 29 8 19 58 43 果 糖 5 9 44 6 16 63 53 单糖 重复 12菌株 平均抑制率 % 重 复 1 重复 2 左 右 抑制率 % 左 右 抑制率 % 麦芽糖 6 9 33 10 9 0 33 甘露糖 8 10 2 3 8 62 41 半乳糖 4 8 50 2 4 50 50 葡萄糖 7 6 0 3 5 40 40 果 糖 9 17 47 12 13 08 28 单糖 重复 ZH 菌株 平均抑制率 % 重复 1 重复 2 左 右 抑制率 % 左 右 抑制率 % 麦芽糖 18 20 10 13 16 19 15 甘露糖 19 27 30 14 17 18 24 半乳糖 21 28 25 7 19 63 44 葡萄糖 27 28 3 13 22 41 22 果 糖 12 13 8 31 32 03 5 通过五种不同的碳源培养基对 4种菌株抗病毒活性测定的结果可以看出， F02， F07两种菌株的效果较好。 菌株培养基：以高氏一号培养基为基础，所选碳源麦芽糖，甘露糖，果糖。 葡萄糖，半乳糖，淀粉，黄豆粉，大米粉，小米粉，玉米粉。 代替原培养基中的 2%淀粉，制作培养基，通过高温灭菌，冷却至常温，并接种 F02菌株；F07 菌株 2种菌株在摇床（ 28℃， 180rpm）中培养七天。 活性测定：取出各个培养基中的对应菌液，以半叶枯斑法，采用健康，长势基本一样的心叶烟做活性测定。 结果及分析 单糖 重复 2菌株 平均抑制率 % 重复 1 重复 2 左 右 抑制率 % 左 右 抑制率 % 淀粉 5 6 17 52 53 2 玉米粉 2 5 60 20 24 17 小米粉 5 11 55 6 9 33 44 大米粉 5 5 0 13 18 28 28 黄豆粉 23 26 12 17 19 11 麦芽糖 28 37 24 24 30 20 22。