奶制品氮含量测定技术的研究本科设计(编辑修改稿)

奶制品氮含量测定技术的研究本科设计(编辑修改稿)内容摘要：

些氨基酸的浓度，同时也取 决于叔肽的量，因为两者都会使福林 酚试剂的量减少 [34]， 在一定的条件下 ,蓝色的深度与蛋白的量是成正比的。 （ 2）优缺点 Lowry 法的优点在于它的灵敏度高 ,与双缩脲法相比，它的灵敏度要高得多。 其缺点有：消耗时间较长 ,而且要精确的控制操作的时间 ,标准曲线也不是严格的直线形式 ,且专一性较差 ,干扰物质较多。 对双缩脉反应发生干扰的离子 ,同样容易干扰福林 酚反应。 而且对后者的影响还要大得多。 需要注意的是，在进行测定时 ,加入福林 酚试剂时要特别小心 ,因为该燕山大学本科生毕业设计（论文） 6 试剂仅在酸性条件下稳定 ,但上述的还原反应只能在 pH=10的 情况下才可以进行 ,故当福林 酚试剂加入碱性的铜 蛋白质溶液中时 ,必须立即混匀 ,以便在磷铝酸 磷钨酸试剂在遭到破坏之前 ,还原反应就能发生 [15]。 考马斯亮蓝法（ Bradford 法） 由于 Biuret 法和 Lowry 法存在着很多的弊端，因此人们开始去寻找更加完善的蛋白质测定方法。 Bradford 在 1976 年根据蛋白质与染料相结合的原理设计而建立了考马斯亮蓝法，这种测定蛋白质的方法具有超过其他几种方法的突出的优点 ,因而得到广泛的应用。 这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法 [16]。 （ 1）实验原 理 由于考马斯亮蓝 G250 染料存在着两种不同的颜色形式 —— 棕红色和蓝色，在酸性溶液中染料与蛋白质中的芳香族氨基酸和某些碱性氨基酸发生反应 ,使染料的最大吸收峰的位置 (λmax)由 465 nm 变为 595 nm， 溶液的颜色也由棕红色变为蓝色。 在一定的蛋白质浓度范围内 (101000 μg/mL)， 蛋白质和染料结合的规律符合比尔定律 (Beer’s Law)[17]。 通过测定在 595 nm 下的吸光度值 A595nm， 可知与其结合蛋白质的量。 蛋白质和染料结合的过程很快 ,只需 2 min左右 即可完全反应 ,呈现出最大光的吸 收 ,并且稳定时间长达 1 h。 超过稳定时间 之后 ,蛋白质 染料复合物就会发生聚合并沉淀出来。 蛋白质 染料复合物具有很高的消光系数 ,因此在测定蛋白质时的灵敏度很高 [18,19]。 （ 2） 优缺点 考马斯亮蓝法的优点在于它的灵敏度高。 与福林 酚试剂法相比，考马斯亮蓝法的灵敏度要高四倍左右 ,其最低的蛋白质检测量可低达 10μg。 这是因为蛋白质与考马斯亮蓝 G250 染料结合后产生的颜色的变化很大 ,再加上蛋白质 染料复合物又有很高的消光系数 ,因而吸光度值随蛋白质浓度的变化要比福林 酚试剂法大的多 [20]。 Bradford 法测 定蛋白质含量的另一个优点在于它测定的快速和简便性。 完成一个样品的测定 , 只需加一种试剂，并且只需要 5 分钟左右即可。 由于考马斯亮蓝 G250 染料与蛋白质结合的过程大第 1章 绪论 7 约只要 2 分钟就可以完成 ,其颜色可以在 1 小时内保持稳定 ,且在 5 分钟至20 分钟之间时的颜色的稳定性最好，因而 Bradford 法完全不用像福林 酚法那样费时并且还必须严格地控制时间 [21]。 除上述优点之外， Bradford 法干扰物质少，如干扰福林 酚试剂法的 K+、 Na+、 Mg2+ 离子、 Tris 缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、 EDAT 等物质均不会对 Bradford 法造成干扰 [22]。 Bradford 法在测定蛋白质含量时也有一些不足之处。 由于不同种类的蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量分布不同 ,因此考马斯亮蓝法在测不同的蛋白质时会有较大的偏差 ,在制作标准曲线时通常选用 γ球蛋白作为标准蛋白以减少这方面的偏差 [23]。 另外， Bradford 法在测定蛋白质含量时也仍然存在一些物质的干扰 ,主要的干扰物质有 :去污剂、 Trtion X100、十二烷基磺酸钠 (SDS)和氢氧化钠 [24]。 第三，标准曲线在蛋白质浓度较大时有轻微的非线性 ,因此不能使用比尔定律直接进行 计算 ,而只能通过标准曲线来测定未知蛋白质的浓度 [25]。 除此之外，在测定中 , 也会有少部分的蛋白 染料复合物吸附于比色皿的壁上 ,实验证明这种蛋白 染料复合物的吸附的影响是可以忽略的 ,实验完毕后用乙醇可以将蓝色的比色皿清洗干净。 高效液相色谱法（ HPLC） 高效液相色谱法（ High Performance Liquid Chromatography / HPLC）又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。 高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用 高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。 该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。 高效液相色谱法是在经典的液相色谱法的基础上发展起来的。 高效液相色谱法是在高压条件下，溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换的过程，它借溶质在两相间的分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起排阻作用的差别使不同溶质得以分离 [26]。 高效液相色谱法有“四高一广 ”的特点： 燕山大学本科生毕业设计（论文） 8 ① 高压：流动相为液体，流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加高压。 ② 高速：分析速度快、载液流速快，较经典液体色谱法速度快得多，通常分析一个样品在 15～ 30分钟，有些样品甚至在 5分钟内即可完成，一般小于 1小时。 ③ 高效：分离效能高。 可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。 ④高灵敏度：紫外检测器可达 ng，进样量在微升数量级。 ⑤ 应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、强极性、 热稳定性差化合物的分离分析，显示出优势。 此外高效液相色谱还有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等优点，但也有缺点，与气相色谱相比各有所长，相互补充。 高效液相色谱的缺点是有“柱外效应”。 在从进样到检测器之间，除了柱子以外的任何死空间（进样器、柱接头、连接管和检测池等）中，如果流动相的流型有变化，被分离物质的任何扩散和滞留都会显著地导致色谱峰的加宽，柱效率降低。 高效液相色谱检测器的灵敏度不及气相色谱。 高效液相色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法。 其中，正向色谱法是采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键 合相）；流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。 常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。 而反向色谱法则一般用非极性固定相（如 C1 C8)；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。 适用于分离非极性和极性较弱的化合物。 RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个 HPLC应用的 80%左右。 课题研究的意义 奶制品已经成为每个家 庭的生活必需品，由于中国家庭较多，对奶制品第 1章 绪论 9 的需求量大，因此有不少厂商为牟取暴利，向奶制品中掺假。 在原奶中掺杂掺假 [27,28]，这种丑恶行为既影响了牛奶的品质，又损害了消费者的健康，在社会产生了极大的反响。 然而在牛奶中掺入廉价的水解蛋白、其他动物乳或者含氮有机化合物等新的掺假方式，传统的检测方法 [2934]则难以检出，现在的乳品检测技术往往是等参假物出来后才能确定相对的检测技术，因而不能未卜先知。 为此，急需建立适应新掺假情况的快速、准确的检测方法。 本实验对牛奶蛋白质进行检验，对牛奶中的蛋白质进行定量检测， 为牛奶的掺假检验提供可靠数据，以确保奶制品的质量和安全。 本研究的目的是从几种传统的蛋白质测定方法中来寻找适合乳品蛋白质测定的方法。 主要选用考马斯亮蓝法 (Bradford法 ) [29,35]，双缩脲法 [31]，与凯氏定氮法的结果进行比较，从中找出最适合乳源蛋白质测定的方法。 由于福林 酚试剂法对实验时间要求严格，而实验室的设备条件不能达到要求，所以本课题中将不再用此方法进行蛋白质含量的测定。 本课题还研究反相高效液相色谱法 [33]对牛乳蛋白和常见的三种可能掺假蛋白质进行定性分析，以期建立有效可行的分析检测乳蛋白 成分和牛乳中蛋白质掺假的方法。 课题研究的主要内容 本课题的主要研究内容包括以下几个问题： （ 1） 通过凯氏定氮法准确测定牛奶中的蛋白质的含量。 （ 2） 使用双缩脲 (Lowry)法、 Bradford方法检测牛奶中的蛋白质的含量，并与国标法结果进行比较。 （ 3） 使用双缩脲 (Lowry)法、 Bradford方法对于牛奶中掺入不同比例的尿素溶液、三聚氰胺溶液样品，样品经前处理后，看能否准确测定牛乳蛋白含量。 （ 4） 应用反相高效液相色谱法（ RPHPLC）对牛奶中的三聚氰胺和尿素的含量进行测定。 燕山大学本科生毕业设计（论文） 10 第 2章 实验材料及方法 用凯氏定氮法测定牛奶中的蛋白质含量 实验仪器及药品 实验仪器：凯氏定氮装置、凯氏烧瓶、冷凝管、接收瓶、烧杯、移液管、100 mL 容量瓶 、 量筒 、 酸式滴定管 、 分析天平、电热套、研钵 、 药匙、玻璃棒、胶头滴管、吸管、烧杯和试管若干、铁架台等。 实验药品：纯牛奶、 96%浓硫酸、 40%(m/m)氢氧化钠溶液、 20 g/L 的硼酸溶液、 、 无水 乙醇、中性甲基红、亚甲蓝溶液、硫酸钾、五水硫酸铜、 30%过氧化氢、蒸馏水等。 实验操作及步骤 试 剂的配制 1) 40%的氢氧化钠溶液： 40 g 氢氧化钠加蒸馏水定容至 100 mL。 2) mol/L 盐酸或硫酸标准溶液：可先配制成 mol/L 的母液，用时吸取 10 mL 定容至 100 mL。 3) 2%的硼酸溶液： 2g 硼酸加蒸馏水定容至 100 mL。 4) 混合催化剂 ： 五水硫酸铜和硫酸钾分别研碎 ,按 1:15 的比例混合均匀。 5) 混合指示剂 ： %的甲基红乙醇溶液（ g 甲基红试剂溶于 20 mL无水乙醇 乙醇，稀释至 100 mL） 20 mL 与 %亚甲基蓝乙醇溶液（ 2 g 亚甲基蓝定溶于 100 ml 无水乙醇中） 10 mL 混合摇匀。 分析步骤 取 6 个凯氏烧瓶，编号 6，其中 3 号为待测样品， 6 号为空白对照，分别按下述方法进行操作。 1) 试样消化。 精密称取牛奶样品（空白样为加蒸馏水） 5 ml,小心放入干燥的凯氏烧瓶中 , 避免试样附着在管壁；加入混合催化剂 10 g, 与试样混合均匀； 再加入 25 mL 硫酸和 5 mL 的双氧水；然后将烧瓶以 45176。 角斜放在支架上，用第 2章 实验材料及方法 11 电炉缓慢加热，当瓶内泡沫消失后强热至沸。 待瓶壁不附有炭化物时，且瓶内液体为澄清浅绿色后，继续加 热 30 min 使其完全分解。 消煮好后关闭热源让其自然降温。 2) 碱化蒸馏。 将消化好并冷却至室温的样品溶液全部转移到 100 mL 容量瓶中，用蒸馏水定容到刻度摇匀。 向 100 mL 接受瓶中加入 20 mL 2%硼酸溶液和 2～ 3滴混合指示液，将接收瓶置于冷凝管下口，使下口浸入到硼酸接收液中。 再吸取 10 mL 定容后的样品液，沿小玻璃杯移入反应室，并用少量的蒸馏水冲洗小玻璃杯，塞紧棒状杯塞。 向小玻璃杯中加入 20～ 30 mL40%的氢氧化钠溶液（过量），慢慢提起棒状杯塞，使氢氧化钠缓慢流入反应室（防止反应室气体从杯塞处 外泄），立即塞紧棒状杯塞，并在小玻璃杯中加入蒸馏水使之密封。 通入蒸汽 5 min，降低接收瓶位置使冷凝管末端离开液面后再继续蒸馏 1 min，用少量蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液并入接收瓶，取下接收瓶。 3) 滴定。 用 mol/L 的盐酸标准溶液滴定接收瓶瓶中的液体，使之刚刚出现灰紫色即为终点，记录所消耗 mol/L 的盐酸标准溶液的体积（ mL）。 4) 计算。 根据所消耗的标准盐酸的体积，计算出总的氮的含量，再乘以蛋白质中氮的转化系数即可得到样品中的蛋白质的含量。 即： 计算公式： )(100]0 .0 1 4c)[( 21  mFVVX 式中： X试样的蛋白质含量 (g/ 100mL) V1滴定样品消耗盐酸体积 ( mL) V2滴定空白样消耗盐酸体积 ( mL) c所用标准盐酸的浓度 ( mol/ L) 0. 014每毫克当量氮的克数 F食品中氮换算为蛋白质的系数，奶制品 F 值为 m奶样品的质量 (g) 燕山大学本科生毕业设计（论文） 12 双缩脲法测定牛奶中的蛋白质含量 实 验仪器及药品。