恶性肿瘤发生、发展的细胞表观遗传机制--20xx--尚永丰--973项目标书

恶性肿瘤发生、发展的细胞表观遗传机制--20xx--尚永丰--973项目标书内容摘要：

胞数据比肿瘤数据更丰富也更系统 ,我们将在恶性肿瘤 与干细胞中分别预测基因表达与表观调控网络 ， 并进一步比较其异同。 通过干扰预测的上游调控节点后以 ChIPPCR 和 ChIPseq 技术对下游节点进行检测，对以上预测模型中的关键调控关系进行验证。 为了通过实验验证贝叶斯网络模型推测出来的因果关系，我们将把它们作为遗传学的上下游关系处理。 这样 就可以人为 地 提高或降低上游事件的水平，例如，转录因子结合或者其他组蛋白修饰水平，而后观察下游事件，如基因表达，或者组蛋白或 DNA 修饰的水平的变化，来证实我们所预测的因果关系。 以组蛋白甲基化修饰作用为例，甲基化转移酶和去甲基化酶是 可用于干扰网络中的特定节点。 譬如我们要证实H3K27me3 抑制基因表达这一关系，我们可以通过抑制正常细胞或者癌细胞的组蛋白甲基化转移酶或者去甲基化酶来调节 H3K27me3 水平，从而观察下游基因表达水平的变化（图 2）。 实际上，一些已报道的因果关系正是利用上述方法和遗传突变在模式生物或细胞实验中发现的。 验证转录因子对某种组蛋白修饰的作用可以通过过表达或者 RNAi 转录因子来直接观察到。 我们将通过过表达或者RNAi 分别上调或者下调转录因子，然后利用 ChIPqPCR 技术检测一些已知的修饰位点或者利用 ChIPseq 技术在全基因水平检测转录因子对全基因组范围内组蛋白修饰的影响。 图 2： 如何通过干扰上游调控节点并以 ChIPPCR 和 ChIPseq 技术 检测下游基因验证预测模型中的关键调控关系 具体方案 如下： 课题 负责人：韩敬东，中国科学院遗传与发育生物学研究所 学术骨干： 吴 旻 ，武汉大学生命科学学院 染色质与组蛋白的多种表观遗传学修饰 关键转录因子与基因的调控关系 转录因子的 ChIPseq实验 基因表达谱差异分析 染色质构型分析 表观遗传因子 ChIPseq实验 绝缘子的基因组分布 表观遗传因子的基因组分布 转录因子的目标基因分布 染色质空间形态与 DNA、组蛋白修饰的因果调控网络 关键转录因子与目标基因的调控网络 多 因 素 SNP 与GWAS分析：鉴定肿瘤发病相关的重要基因突变相互关系 恶性肿瘤发病因素预测的因果网络模型 RNAi与基因敲除研究：验证肿瘤发病相关转录因子与基因的影响范围 恶性肿瘤高通量数据的整合与网络的计算预测 四、年度计划 研究内容 预期目标 第 一 年 1） 多种手段研究肺癌细胞肿瘤抑制基因甲基化状况，开展肿瘤转移相关 DNA 甲基化标志物研究；开展 PcG 蛋白表达变异与肿瘤抑制基因表观遗传失活关系研究； 2） 利用高通量芯片、 ChIPChip、ChIPseq、酵母双杂交、免疫沉淀结合质谱等技术，针对 TGFβ和雌激素信号通路相关因子，如转录因子 Smad ER 及其转录辅助因子，筛选新的组蛋白修饰基因或 miRNA； 3） 利用 RNASELEXseq 等技术平台系统筛选鉴定与肿瘤相关蛋白相互作用的 ncRNA；检测 ncRNA 的表达谱； 4） 诱导或抑制 EMT 表型。 比较不同细胞系在 EMT 前后其基因表达谱变化， 用 MeDIPseq 法比较基因组范围内 DNA 甲基化变化情况，并用 ChIPseq 法比较与转录相关的主要的组蛋白修饰标志如激活性的组蛋白乙酰化、 H3K4 甲基化，抑制性的 H3K9， H3K27， H4K20甲基化等在全基因组范围内的分布变化规律。 5） 分离乳腺良性增生患者及乳腺癌患者 微环境中的成纤维细胞 、 浸润巨噬细胞 、 浸润的单核巨噬细胞 ，分析 miRNA及 mRNA的表达谱，研究不同类型的乳腺癌以及不同侵袭转移能力的乳腺癌中上皮细胞与间质细胞的表达谱差异 ； 6） 开发能够自动整合并利用多个异质实验数据的因果推断方法。 包括 去除反映单个数据源自身特征的背景信号，子网络的拼接与集成，观测型实验数据与 (基 因敲1） 找出有代表性的肿瘤抑制基因，分析甲基化谱，筛选出一组肿瘤转移相关 DNA 甲基化标志物；掌握肿瘤组织中多种 PcG 蛋白表达变异规律； 2） 获得新的组蛋白修饰组分； 3） 筛选出一批肿瘤相关的 ncRNA；并确定 ncRNA 及相关蛋白的表达谱； 4） 优化 EMT 表型诱导条件，完成基因表达谱及 MeDIPseq，ChIPseq法比较 DNA甲基化及主要组蛋白修饰谱变化实验 ； 5） 发现与肿瘤发生发展和转移相关的不同 间质细胞的表型特征，以及一些重要的免疫相关蛋白、间质细胞中 miRNA及 mRNA的表达改变； 6） 建立 能够自动整合并利用多个异质实验数据 ，适用于大规模高噪声的组学数据 的因果推断方法 ，并开发为计算软件。 研究内容 预期目标 除、 RNA 沉默等 )干预型实验数据的因果信息集成等多个问题。 第 二 年 1） 分析围绕甲基化基因启动子周围的组蛋白修饰状况，开展核小体在 DNA 甲基化扩展过程中的作用研究；开展肿瘤转移相关甲基化标志物多中心验证研究； 2） 利用免疫共沉淀、 GST pulldown、细胞内共定位等蛋白质间相互作用技术验证筛选获得的组蛋白修饰复合物中各成员间的相互作用，定位相互作用的结构域 /区域。 3） 研究筛选到的 ncRNA 与蛋白质、DNA 或 RNA 等生物大分子的相互作用； 4） 对克隆得到的 新的潜在 EMT 调控因子用分子生物学及细胞生物学的手段进行功能分析 ； 5） 通过基因过表达或敲降的方法，研究 差异表达的基因或 miRNA 对成纤维细胞 、巨噬细胞 及肿瘤细胞的生物学行为的影响，尤其是肿瘤细胞侵袭转移能力的影响； 1） 探明组蛋白修饰与甲基化 DNA 之间的关联性，证明核小体在 DNA甲基化扩展过程中的作用 ； 2） 明确组蛋白修饰复合物中各成员间的相互作用及其相互作用方式 ； 3） 初步确定 ncRNA 的作用靶点，特别是与蛋白的相互作用； 4） 发现一些 新的潜在 EMT 调控因子； 5） 发现 几个间质 细胞 来源的 与肿瘤发生发展和转移 密切 相关的 新的分子 ； 6） 建立 能够自动 进行 因果关系的特征选择方法 ，并开发为计算软件。 探索 推断肿瘤发生与发展动态关系 的方法 ； 7） 发表 56篇 IF5的研究论文 ,12篇 IF10 的研究论文。 申请专利12 项。 研究内容 预期目标 6） 对于大规模因果推断问题，使用现有的贝叶斯因果推断方法，还面临有限的数据资源与急剧增大的网络搜索空间的矛盾。 为了保证学习结果的鲁棒性，我们拟开发一系列能保持因果关系的特征选择方法来解决这个问题。 第 三 年 1） 研究影响 DNA甲基化和组蛋白修饰的关键酶，找出连接甲基化与组蛋白的蛋白。 在不同病变人体组织中肿瘤 转移相关基因 DNA 甲基化形成、扩展和维持规律研究； 2） 利用基因过量表达和敲低 /敲除技术、组蛋白修饰等分析技术检测组蛋白修饰因子对组蛋白修饰的影响及不同修饰间的相互影响。 检测组蛋白修饰候选因子对 TGFβ、雌激素信号通路等相关的下游靶基因表达的影响。 确定组蛋 白修饰复合物中各成员间物理上的相互作用与功能上的相互作用的关系； 3） 研究 ncRNA在表观遗传修饰和转录水平上对基因转录的调控作用 ；以及 ncRNA 相关的信号调控通路； 4） 对克隆得到的 新的潜在 EMT调控因子用分子生物学。