钼铜联合对小鼠免疫功能的影响毕业论文(编辑修改稿)

钼铜联合对小鼠免疫功能的影响毕业论文(编辑修改稿)内容摘要：

出脾的重要通道。 (4) 脾小结 亦称脾小体，即淋巴小结，位于动脉周围淋巴鞘的一侧，主要由 B 细胞构成，发育良好者也可呈现明区、暗区和小结帽，帽朝向红髓。 与淋巴结的淋巴小结不同的是，脾小结内有中央动脉的分支穿过，当受到抗原刺激引起免疫应答时，脾小结增多、增大。 (5) 边缘区 位于白髓与红髓 之间，宽 100~500μm，呈红色。 细胞排列较白髓稀疏，但较红髓密集，主要含 B 细胞，也含 T 细胞、巨噬细胞、浆细胞和其他各种血细胞。 中央动脉分支而成的一些毛细血管，其末端在白髓与边缘区之间膨大形成边缘窦，它是血液和淋巴细胞进入脾内的重要通道。 边缘区是脾内免疫细胞捕获、识别、处理抗原和诱发免疫应答的重要部位。 (6) 红髓 占脾实质的大部分，分布于被膜下，小梁周围，白髓及边缘区的外侧。 因含大量的红细胞，在新鲜切面上呈红色，因而得名。 红髓包括脾索和脾血窦。 (7) 脾索 为富含血细胞的淋巴索，相互连接成网 ，内含 T 细胞、 B 细胞、浆细胞、巨噬细胞和其他血细胞。 根据细胞成分的不同及毛细管的有无，可将脾索分为滤过区和非滤过区两种不同功能的区域。 滤过区含有鞘毛细血管和毛细血管开放的终末部，两者周围均有大量的巨噬细胞，尤其是在鞘毛细血管周围，巨噬细胞和网状细胞形成椭圆形鞘，又称椭球。 鞘结构有时很紧密，此时滤过作用很低；有时呈松散海绵状，鞘内充满血浆和血细胞，此时滤过作用较强。 鞘毛细血管可间歇性地收缩或扩张，有调节血流的作用。 当血液从滤过区的血管渗出时，巨噬细胞即可清除衰老的红细胞、抗原抗体复合物或其他异物。 非滤过区几乎 不含毛细血管，分布在几个滤过区之间，其中含有较多的 B 细胞、浆细胞、少量的 T 细胞和巨噬细胞。 脾是免疫应答的重要场所，构成机体免疫的第三道防线。 此外，还有滤血、储血、和造血的作用。 (1) 免疫应答 脾内含有大量的淋巴细胞、浆细胞等多种免疫细胞，侵入血内的病原体，如细菌等，可引起脾内发生免疫应答，脾的体积和结构也发生变化。 体液免 4 疫应答时，淋巴小结增多增大，脾索内浆细胞增多；细胞免疫应答时，动脉周围林巴鞘显著增厚。 (2) 滤血 脾内含有大量的巨噬细胞，可吞噬清除血液中的病原体和衰老的血细胞。 脾内滤血的 主要部位是脾索和边缘区。 当脾肿大或功能亢进时，红细胞破坏过多，可引起贫血；而切除脾后，学内异形的衰老红细胞会大量增加。 (3) 储血 脾索和脾窦内可以储存一定量的血液。 在动物剧烈运动、大量失血、缺氧时，血液从脾索和脾窦内释放加入血液循环，已满足机体的需要。 (4) 造血 胚胎早期的脾具有造血功能，但骨髓开始造血后，脾逐渐变为一种淋巴器官，仅能产生淋巴细胞和浆细胞。 不过，此时脾内仍有少量的造血干细胞，当机体严重缺血或某些病理状态下，脾可恢复造血功能。 2 材料与方法 主要仪器及设备 SZ97 自动三重纯水蒸馏器，上海亚荣生化仪器厂； 京制电子天平，赛多利斯科学仪器北京有限公司（ Max: 200 g， d= g）； KDT 电脑生物组织烤片机，浙江省金华市科迪仪器设备有限公司； KDBM 生物组织包埋机，浙江省金华市科迪仪器设备有限公司； Leica 生物组织切片机，上海徕卡仪器有限公司； 双层铁皮电炉（ A 型），上海武定电器厂； 显微镜（ XS212103），型号 001783； 高速离心机，上海亚荣仪器有限公司； 数码成像系统（ DP70），上海长方光学仪器厂； 酶标仪，上海闪谱生物技术有限 公司。 主要试剂 化学药品 钼用钼酸钠（ Na2MoO4178。 2H 2O），天津市化学试剂四厂，含钼量为 %； 铜用硫酸铜（ CUSO4178。 5H2O），天津市化学试剂四厂； 多聚甲醛（分析纯），天津市科密欧化学试剂开发中心； 苏木素，上海楷洋生物技术有限公司； 甲明矾（硫酸铝钾），北京化工厂； 伊红，上海楷洋生物技术有限公司； 乙醇（分析纯），洛阳昊华化学试剂有限公司； 二甲苯（分析纯），天津市石英钟厂霸州市化工分厂； 标准品稀释液，上海荣奕生物技术有限公司； 酶标试剂，上海荣奕生物技术有 限公司； 5 样品稀释液，上海荣奕生物技术有限公司； 显色剂 A 液，上海荣奕生物技术有限公司； 显色剂 B 液，上海荣奕生物技术有限公司； 终止液，上海荣奕生物技术有限公司； 浓缩洗涤液，上海荣奕生物技术有限公司； 小鼠免疫球蛋白 IgG酶联免疫分析试剂盒 试剂盒组成：说明书、封板膜、密封袋、酶标包被板、标准品、标准品稀释液、酶标试剂、样品稀释液、显色剂 A液、显色剂 B液、终止液、浓缩洗涤液 统计学处理 数据采用 ，两组间差异采用ｔ检验；多组间差异采用Ｓ－Ｎ－Ｋ的方 差分析，分析前各组及组间进行正态分布和方差齐性检验 [12]。 主要药品及试剂的配制 HE染色相关试剂 先加少量 PBS，在电炉上加热使 4 g 多聚甲醛溶解，完全溶解冷却，再加 PBS至 100 mL，调节 pH = 4， 4 ℃ 冰箱保存。 （ 1）迈耶氏改良的苏木精染液 甲液： 苏木素 1 g； 无水乙醇 100 mL 乙液： 甲明矾（硫酸铝钾） 50 g； 蒸馏水 300 mL 两种溶液分别配制，溶解后混合，煮沸 2~3 min，加蒸馏水至 1000 mL，最后再加入 g 碘酸钠。 （ 2）伊红染液 伊红 g； 85 %酒精 100 mL 将伊红加入酒精内搅拌，待其全部溶解后即可使用。 （ 3）分化液（ 1 %盐酸酒精溶液） 盐酸 1 mL； 70 %酒精 99 mL 试验动物 75 只 21 日龄健康雄性昆明种小鼠，购自于郑大动物实验中心。 动物分组与处理 实验动物选用 75 只健康雄性小鼠，随机分为 5 组，组 I（钼 0mg/L，铜0mg/L）；组 II（钼 0mg/L，铜 50mg/L)；组 III（钼 200mg/L，铜 50mg/L）；组 IV（钼 400mg/L，铜 50mg/L）；组 V（钼 800mg/，铜 50mg/L）组；每组15 只，分别在 9 周剖杀小鼠，每次每组剖杀 5 只小鼠， 如表 1。 按小 6 白鼠饲养管理条件要求进行管理，按时清理笼具和打扫鼠舍卫生，对小鼠的体况表现等做好试验记录。 在 5 周、 7 周、 9 周时用摘眼球取血法剖杀小鼠，取出脾脏，固定包埋处理后，制得切片，经 HE 染色，用显微镜观察小 鼠脾脏组织病理形态学变化；将血液静置 30 分钟，高速离心取上清液进行小鼠免疫球蛋白酶联免疫分析并用酶联免疫分析小鼠血清中 IgG 含量。 表 1 小鼠饮用水中钼铜含量表 （ mg/L） Table1 The different doses of molybdenum into drinking water I 组 II 组 III 组 IV组 Ⅴ 组 钼含量 （ mg/L) 0 0 200 400 800 铜含量 （ mg/L） 0 50 50 50 50 动物组织病理切片的制作 取材与修块 本实验用眼球放血法处死小鼠后，无菌条件下，立即采集小鼠的血液、脾脏。 修整组织块，以确保组织块固定和浸蜡的质量。 固定 采集的组织及时投入固定液内进行固定，以防腐败。 并做好标记，以便于识别。 固定液用量一般为组织块体积的 10~20倍。 组织固定 24 h，每 8 h 换一次固定液。 固定后加入 70 %酒精中洗去多聚甲醛。 冲洗 固定后的组织用 70 %酒精稍加清洗后进行修切， 去掉不需要部分，选择好包埋部分。 脱水 脱水的方法是在室温下将脱水剂用水配成不同的梯度浓度，然后将组织块置入其逐级进行脱水。 本实验用 50 %、 70 %、 80 %、 90 %、 95 %（各 2 h）， 100 %（Ⅰ）100 %（Ⅱ）各 h 的酒精。 透明 组织块脱去水分之后，使用二甲苯透明。 过程： 100 %酒精：二甲苯（ 1:1） 20 min、二甲苯（Ⅰ） 15 min、二甲苯（Ⅱ） 15 min。 浸蜡 组织块经透明之后，在恒温设备中进行浸蜡本实验选用的是熔点为 54~56 ℃的石蜡，并将恒温箱调至 58 ℃，选用二甲苯：石蜡（ 1:1）的混合液进行预处理约 30 min， 58 ℃，然后浸入纯石蜡（Ⅰ） 2~ 3h，纯石蜡（Ⅱ） 2~3 h。 包埋 7 在小纸盒内注入溶化的石蜡，将已浸的组织块置入其内，使欲切之组织面向下，使蜡块迅速冷却硬固。 石蜡块的整修 整修时将上下左右多余的石蜡修掉，使石蜡块上下两面成平等的面，将组织四周的蜡层遗留大于 2 mm。 切片与展片 将切片刀安装妥当，与组织块成 5176。 夹角，厚度为 5 μ m，调节好刀口与组织块的距离便可开始切片。 刚开始 使用旧刀片，修整蜡块，待修至组织且切片均匀平展时换上新刀片，开始切片。 将切片置于温水（ 45~48 ℃）中展片。 贴片及烤片 待石蜡切片自然伸展平，且切片边沿的蜡开始融化时，从水中捞取切片，拨正位置，控干水分，然后放入温箱内烘干（ 65~68 ℃， 1 h）。 HE 染色 染色的目的在于使细胞质及细胞核不同成分之间有明显的对比色，以利于显微镜下观察。 苏木精本身不是染料，需经氧化以后形成氧化苏木精才有染色作用。 HE 染色流程图： 欲染切片  二甲苯Ⅰ  二甲苯Ⅱ  二甲苯 :100 %酒精（ 1:1） 15 min 15 min 1 min  90 %酒精 95 %酒精Ⅱ 95 %酒精Ⅰ 100 %酒精Ⅱ 100 %酒精Ⅰ 5 min 5 min 5 min 5 min 5 min  80 %酒精  70 %酒精  50 %酒精  蒸馏水  苏木精  HCl 酒精 2 min 2 min 2 min 2min 3min 10 s  伊红染色 90 %酒精 80 %酒精 70 %酒精 50 %酒精 自来水 15s 2 min 2 min 2 min 2 min 5 min 95 %酒精Ⅰ  95 %酒精Ⅱ  100 %酒精Ⅰ  100 %酒精Ⅱ  二甲苯Ⅰ 3 min 3 min 3 min 3 min 10 min  显微镜观察  中性树胶、封片  二甲苯Ⅱ 10 min 酶联免疫分析  8 IgG酶联免疫分析 样本处理及要求： 血清：室温血液自然凝固 1020h，离心 20h 左右（ 20xx3000r/min）。 仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。 1 标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品空 10 空，在第一、第二孔中分别加标准品 100μ l，在第一、第二孔中分别加标 准品稀释液 50μ l，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取 100 分μ l 别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液 50μ l，混匀；然后在第三和第四孔中各取 50μ l 弃掉，再各取50μ l分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液 50μ l，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取 50μ l分别加到第七、八孔中，再在第七、八孔中分别加标准品稀释液 50μ l，混匀后从第七、八孔中分别取 50μ l 加到第九、第十孔中，再在第九、十孔中分别加标准品稀释液 50μ l，混匀后从第九、第十孔中各取 50μ l弃掉。 （稀释后各 孔加样量都为 50μ l，浓度分别为 480ug/mL， 320ug/mL，160ug/mL， 80ug/mL， 40ug/mL）。 2 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步骤操作想同）、待测样品孔。 在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液 40μ l,然后再加待测样品 10μ l（样品最终稀释度为 5倍）。 加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3温育：用封板膜封板后置于 37℃温育 30 分钟。 4 配液：将 30（ 48T 的 20 倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水 30（ 48T 的 20 倍）倍稀释后备用。 5洗涤 ：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此重复 5次，拍干。 6加酶：每孔加入酶标试剂 50μ l，空白孔除外， 7温育：操作同 3。 8洗涤：操作同 5。 9显色：每孔加入显色剂 A 50μ l，再加入显色剂 B 50μ l，轻轻震荡混匀， 37℃避光显色 15min。 10 终止：每孔加入终止液 50μ l，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 11 测定：以空白空调零， 450nm 波长依序测量各孔的吸光度（ OD 值）。 测定应在加终止液后 15分钟以内进行。 计算： 9 以标准物的浓度为横坐标， OD值为纵坐标，在坐标纸 上绘出标准曲线，根据样品的 OD 值由标准曲线查出相应的浓度。