课题申请报告-力学刺激对植体-骨界面骨系细胞mrna表达的影响(编辑修改稿)

课题申请报告-力学刺激对植体-骨界面骨系细胞mrna表达的影响(编辑修改稿)内容摘要：

荷的标准力值。 二）、 体外培养的成骨细胞、破骨细胞在间断力学刺激下基因表达谱的基因芯片检测 1）、体外培养成骨细胞和破骨细胞，观察不同负荷下的生物学性状。 （已积累经验） 2）、将前期实验测出的标准“生理”负荷和“超”负荷换算 成大气压，通过气压加压装置间断加力于体外培养的成骨细胞和破骨细胞，其力学参数参考前期实验。 3）、将“生理”负荷和“超”负荷作用于成骨细胞，以 1h ,24h ， 48 h， 4d 为取样点，未加力为对照，抽提 mRNA 后，逆转录标记 cDNA ，应用基因芯片技术检测成骨细胞基因表达谱的时序变化。 (取样时间点系根据前期实验总结、临床经验、及参考相关文献提出 ) 4）、将“生理”负荷和“超”负荷作用于破骨细胞，以 1h ,24h ， 48 h， 4d 为取样点，未加力为对照，抽提 mRNA 后，逆转录标记 cDNA ，应用基因芯片技术 检测成骨细胞基因表达谱的时序变化。 三）、体内 骨组织不同负荷和时间下成骨细胞和破骨细胞基因表达谱基因芯片检测 1）、 90 只 SD 大鼠动物模型，随机分为三组，每组各 30 只。 2）、 I 组：按“生理”负荷力值加载，随机选 5 只大鼠，分成 6 小组，分别在1h 加载后，以及 24h, 48 h， 4d 加载（ 每天 3 次，每次 1 小时）后 取下大鼠股骨，分别分离种植体和骨组织，取与种植体交界处骨组织，采用激光捕获显微分离技术分别分离出成骨细胞和破骨细胞，将每小组 5 个样品的成骨细胞（或破骨细胞）等量混合，抽提 mRNA，逆转录标记 cDNA, 基因芯片检测成骨细胞和破骨细胞的基因表达谱（基因芯片为大鼠 Oligo 基因芯片， 6000 个 cDNA 的微阵列，由北京博奥生物芯片有限公司协助制备）。 3）、 II 组：按“超”负荷力值加载后，随机选 5 只大鼠，分成 6 小组，分别在1h 加载后，以及 24h， 48h,6d 加载（ 每天 3 次，每次 1 小时）后 取下大鼠股骨，其余方法同 I 组。 4）、 III 组：无负荷加栽组，与上两组同期取种植体周围骨组织，抽提成骨细胞和破骨细胞 mRNA，逆转录标记 cDNA,因表达谱。 四）、 采用 RTPCR 检测不同负荷下 表达差异明显的基因 拟对在骨形成和骨吸收中基因表达差异（上调或下调）超过 5 倍的基因，应用RTPCR 法进行基因表达水平的半定量测定，并结合基因数据库分析此生理过程中涉及功能性基因的种类和变化的幅度，以期阐明“标记”基因。 1）、样品在做基因芯片检测之前，提取部分细胞，标记，液氮冻存备用。 2）、据基因芯片检测的结果，对 I、 II 组基因表达差异最大的数个基因通过逆转录 聚合酶链反应（ RTPCR）法，抽提细胞的总 RNA，逆转录，再通过随机引物法对此类基因进行基因表达水平的半定量分析。 结合基因数据库，分析这些基 因的主要功能及作用。 五）、统计学分析处理 统计学分析各项实验结果，明确间断压力下的骨形成和骨破坏过程中，成骨细胞和破骨细胞特异性基因的表达和时序变化，通过体内外实验的对比，探讨成骨细胞和破骨细胞在间断力学刺激下的耦联机制。 生理负荷 超负荷 基因芯片 基因芯片 基因芯片 基因芯片 体外培养的成骨细胞(OB)和破骨细胞 (OC) 体外培养的成骨 (OB)细胞和破骨细胞 (OC) 体外 OB、 OC 基因表达谱的时序变化 体外 OB、 OC 基因表达谱的时序变化 RTPCR 法检测 OB、 OC 表达差异最大的几个基因； 结合基因数据库，明确“标记”基因及功能。 骨界面 OB、 OC 基因表达谱的时序变化 骨界面 OB、 OC 基因表达谱的时序变化 研究骨形成到骨吸收质的变化过程中， OB、 OC 基因调控机理。 激光捕获 激光捕获 生理负荷 超负荷 可行性分析： 项目是在大量查阅国际最新相关文献资料，并结合申请者本人相关的前期工作的基础上，采用了多种学科、多种技术相结合的综合性研究方 法，从而保证了立题的新颖性、科学性和可靠性。 本项目在技术思想上是课题“。 ”的延续和发展。 在前期相关的研究中发现，在生理范围内，机械应力的增加导致与成骨相关基因表达（比如转化生长因子 β 骨形成蛋白 4）的激活或上调，有理由相信可能存在破骨相关基因的灭活或下调（或相对水平的下调）。 反之亦然。 此二者对比，结合相同条件下体内外基因表达谱的异同，我们预期能筛选出与骨形成、骨破坏以及信息耦联密切相关的特异性基因，并可进一步研究其互关系。 项目申请者多年从事生物力学、分子生物学的相关的研究，在临床和科研 上有着多年的组织和实践经验。 近年先后承担省科技攻关计划市科委基金等科研项目积累了与该项目相关的工作经验，特别是将力学刺激传递到骨系细胞的动物实验模型的建立，为本项目的完成奠定了基础。 与课题相关的基因芯片检测技术比较成熟，课题组成员有一定的工作经验和技术，已同生物科技有限公司，生物芯片有限公司达成协议，基因芯片的制备和相关技术支持可以得到保证。 激光捕获显微分离技术（ Laser Capture Microdissection LCM）在软组织应用以很成熟，课题组成员有在骨松质捕获细胞的经验，所需设备 已具备。 本项目的特色与创新之处。 体内种植体 — 骨界面区域的骨组织 提取骨界面取材的OB 和 OC 体内种植体 — 骨界面区域的骨组织 提取骨界面取材的OB 和 OC 1）不仅从体外，还通过动物模型从体内探讨力学刺激作用下成骨细胞和破骨细胞上千个基因的动态表达。 2）首次应用基因芯片技术从整个基因组的宏观水平，探寻不同负荷状态下，骨形成和骨破坏的基因调控机制，以及成骨细胞和破骨细胞在其中的作用，及其可能的耦联机制。 3）在体内实验中采用激光捕获显微分离技术（ LCM），从 骨组织与人工材料界面捕获所需的成骨细胞和破骨细胞，使相关基因的检测更加准确。 4）通过本课题的研究可能引出的思考： A）不同类型的应力，不同的作用方式和时间均有可能 影响基因的表达，本课题为简化实验，突出重点，选用间断力学刺激作为力的作用形式。 根据本课题所测得的特异性基因表达的结果为基础，针对不同应力形式对骨系细胞基因表达的影响是否存在差异这一尚存争论的问题，通过进一步的实验，应用聚类分析等方法，可以给出基因水平的判别。 B）、若体内实验发现的特异性基因表达是体外细胞水平实验中没有出现的，则很有可能是成骨细胞和破骨细胞耦联的作用方式，可为进一步研究两者相互作用方式提供实验基础。 C）、骨形成和骨吸收不但和应力有关，也和激素、生长因子等有密切的关系，而这是本课题没有涵盖的 ，这也为我们提出了以后发展的方向 结合蛋白质组学层面的研究，以期阐明骨形成、骨破坏的分子机理。 年度研究计划及预期研究结果。 年度研究计划 本项目需 3 年时间完成，自 20xx 年 1 月 20xx 年 12 月 完成研究方法技术路线中的第一部分，即动物实验模型的建立和力学指标的确立。 完成研究方法技术路线中的第二部分，即体外培养的成骨细胞、破骨细胞在间断力学刺激下基因表达谱的基因芯片分析。 完成研究 方法技术路线中的第三部分，即 体内 骨组织不同负荷和时间下成骨细胞和破骨细胞基因表达谱基因芯片检测。 完成研究方法技术路线中的第四部分：即采用半定量RTPCR 检测不同负荷下表达差异明显的基因。 完善补充实验，数据分析总结，完成论文。 预期研究成果 成果以论文形式发表并组织鉴定。 1）、明确生理性负荷和超负荷的力学参数和时间参数，以及相应的骨组织形态学的改变。 2）、生理负荷和超负荷下成骨细胞和破骨细胞的生物学性状。 3）、明确间断力学 刺激下成骨细胞和破骨细胞的特异性基因表达及时序变化。 4）、探寻新的未知的与骨形成或骨破坏密切相关的基因，为进一步的深入研究提供新的线索。 5）、发现反映从骨形成到骨破坏这个质的变化过程中的“标记”基因，进而探讨其临床意义。 6）、通过体内试验，明确无负荷、生理负荷和超负荷状况下，骨组织基因表达的差异。 结合体外细胞水平的实验，探讨骨形成和骨破坏的基因调控机制以及成骨细胞和破骨细胞的耦联机制。 （二）研究基础与工作条件 工作条件 1）、配有相应的种植仪器和种植材料，动物实验技术成熟 , 加力装置已具备。 2）、 Zwick1454 自动材料万能试验机（ Ulm,Germany） 及气压加载容器可以保证课题需要。 3）、实验室现有的主要实验仪器： （ 1）、病理制片配套设备 （ 2）、石蜡、冷冻、恒冷、超薄切片机 （ 3）、显微像系统 （ 4）、荧光、相差、倒置、自动照相显微镜 （ 5）、细胞培。