项目2：微生物发酵技术任务1：微生物菌种筛选与保藏

项目2：微生物发酵技术任务1：微生物菌种筛选与保藏内容摘要：

要求在 4～ 4℃ 下。 液体石蜡法适用于不产孢子的菌种。 (三 )液体石蜡低温封存法  具体操作是：菌种为斜面培养菌种 ， 斜面不宜过长；选择纯净优质石蜡油 ， 置三角烧瓶中经过 121℃ 高压蒸汽灭菌 1～2h， 将其放烘箱中 (160℃ 左右 )干热处理 ，去除灭菌时渗入的水分 ， 待石蜡油变得清澈透明后冷却即可加入斜面 ， 斜面上不能出现气泡 ， 液蜡添加量以高出斜面顶部约 1cm左右为宜。 (四 )干燥保藏  微生物生长需要水分 ， 干燥法是使菌处于干燥条件下停止生长及处于休眠状态 ，达到较长期保藏的目的。 此法用于细菌芽孢或产分生孢子的菌种 ， 是现在发酵工业生产中较常用的菌种保藏方法。 为了转接方便 ， 控制接种量以及对菌种的保护作用 ， 通常将菌种的分生孢子 、 芽孢 ， 甚至菌丝体吸附于一些载体表面放至干燥容器里进行常压干燥或真空干燥 ，所用载体有沙土 、 滤纸 、 硅胶及大 (小 )米等。 取河 (海 )沙 ， 过 (24目 )筛 ， 用 10％ 盐酸浸泡 24h， 倒去盐酸用清水冲洗至 pH呈中性 ， 去水烘干或晒干。 取菜园或果园土粉碎过筛 ， 把烘干的沙土按 3： 2或 1： 1混合装入指形管或高 100mm，直径为 10mm的小试管中 ， 高约 1cm(约 2g)， 塞棉塞121℃ 灭菌 1h， 也可用 170℃ 2h干热灭菌 (或蒸汽三次间歇灭菌 )， 蒸汽灭菌后需烘干。 经肉汤检查确实证明无菌即可使用。 将要保存的斜面菌种制成浓孢子悬液 (≥ 106/ml)， 用灭菌滴管或吸管吸取孢子悬液滴入无菌沙土上 ， 每管约 ～ ，用接种环将其混合均匀。  也可将真菌分生孢子用接种环从斜面直接挑取放入沙土中。 然后将沙土管抽真空干燥。 这时管内砂土松散 ， 表明已干燥。 将干燥的砂土管放置在干燥器或密闭容器内 、 干燥器下部放置变色硅胶等干燥剂 ， 于 4℃ 下保存。 从斜面取出的孢子放入沙土管中混匀后 ， 可以不抽真空直接放干燥器内保存。  在沙土保藏初期 ， 菌死亡率高 ， 以后逐渐减慢 ， 存活下来的孢子在以后保存期间稳定性较好 ， 保藏的有效时间与菌种存活率的关系见图 210。 用沙土管保藏的某些抗生素产生菌保藏期可达 18年 (土霉素和链霉素产生菌 )到 22年(新霉素产生菌 )， 但对利福霉素 、 卡那霉素 、 四环素等容易产生变异的菌种 ，就不适合作长期的沙土管保存。  本法是将要要保藏的微生物细胞或孢子吸附在灭菌滤纸上 ， 干燥后冷藏。 是 3滤纸剪成 5mm 50mm的小条 ， 放入干燥的培养皿中灭菌。 将培养好的菌种用灭菌脱脂乳或奶粉复原乳制成孢子悬液 ， 用灭菌镊子将准备好的滤纸条在灭菌操作下浸入菌悬液中 ， 充分吸附菌细胞 ， 取出后放入灭菌小试管或安瓿管中 ， 在真空干燥机上抽干 ， 真空条件下火焰熔封 ， 冷藏。 (小 )米保藏法  是根据我国制曲原理加以改进的一种方法。 此法是将曲霉等大量产生孢子的菌直接培养在大 (小 )米培养基上，待孢子充分成熟后干燥后保藏。 (五 )甘油管保藏法  本法也是利用微生物在甘油中生长和代谢受到抑制的原理达到保藏目的。 其方法是 ， 将 80%的甘油高压蒸汽灭菌待用。 将培养好的斜面菌种用无菌种用无菌水制成高浓度的菌悬液 (108～ 1010/ml)。 取1ml灭菌甘油放入与甘油充分混匀 ， 使甘油浓度约为 40%， 于 20℃ 下冻存。 (六 )真空冷冻干燥法  真空冷冻干燥保藏法是兼具低温 、 干燥 、除氧三方面菌种保藏的主要因素 ， 除不宜于丝状真菌的菌丝体外 ， 对病毒 、 细菌 、 放线菌 、 酵母及丝状菌孢子等各类微生物都适用 ， 不宜用冻干法保存的微生物不到 2%。 冷冻干燥保存的菌种存活时间长 、 效果好 ， 一般菌种可保存 5年以上 ， 有的可保藏 15年以上不发生变异。 还具有体积小 、 不易污染 、 便于运输等优点 ， 是一种用得最为广泛的菌种保藏方法。 (六 )真空冷冻干燥法  冷冻干燥法是在低温下快速将细胞冻结 ，然后在真空条件下干燥 ， 使微生物的生长和酶活动停止。 为了防止在冷冻和水分升华过程中对细胞的损害 ， 要采用保护剂来制备细甩悬液 ， 使菌在冻结和脱水过程中起到保护作用的溶质 ， 通过氢键和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。 (六 )真空冷冻干燥法  即是使样品中的水分在冰冻状态下 ， 抽真空减压 ，使冻结的冰直接升华为水蒸气 ， 使样品达到干燥。 干燥后的微。