青岛农业大学生物科学毕业论文大豆脂肪酸含量的测定以及色谱分析(编辑修改稿)

青岛农业大学生物科学毕业论文大豆脂肪酸含量的测定以及色谱分析(编辑修改稿)内容摘要：

根据样品的具体 特点选择合适的甲酯化方法。 分析大豆脂肪酸组分的方法，过去是首先常采用索氏抽提法或二氧化碳临界 3 萃取法获得脂肪 [11]，使用有机溶剂溶解脂肪，获得待测样品，再进一步对样品甲酯化，通过 GC 分析得到脂肪酸组分的图谱。 此法花费时间极长，溶剂用量大，而且效率并不高，但检测精确度高。 而目前实验室中广泛采用的是豆粉直接甲酯化法，即通过粉碎机将大豆籽粒磨成豆粉，然后加入萃取试剂，通过离心取上清液然后进行甲酯化以及 GC 分析 [12]。 豆粉直接甲酯化法适用于大量样品的快速检测，可以避免传统方法长时间的加热对脂肪酸的组分产生影响， 而且此法精密度上与索氏抽提法没有显著差异，可以节约大量的时间，提高实验的效率。 气相色谱（ gas chromatography，简称 GC）技术的发展已有 50多年的历史，它现在是一种相当成熟的分离技术，因分析速度快、分离效率高、灵敏度高、易于实现自动化等优点被广泛使用。 从俄国植物学家茨维特（ ）在 1901年首先发现并命名色谱，到现在气相色谱 质谱联用技术的成熟，气相色谱在分析中逐渐确立了自己在历史舞台上的位置。 GC 是利用试样中各组份在气相和固定液液相间的分配系数不同而进行分离的。 当气化后 的试样被载气带入色谱柱中运行时，组份就在其中的两相间进行反复多次分配。 由于固定相对各组份的吸附或溶解能力不同，因此各组份在色谱柱中的运行速度就不同，结果在载气中分配浓度大的组分先流出色谱柱，而在固定相中分配浓度大的组分后流出。 经过一定的柱长后，便彼此分离，按顺序离开色谱柱进入检测器，产生的离子流讯号经放大后，在记录器上描绘出各组份的色谱峰 [13]。 对相同的样品，前期处理的试剂不同，实验结果也会产生明显的差异，采用正己烷进行脂肪酸的溶解浸提，与采用苯：石油醚 =1： 1 的萃取液进行萃取，效果明显不同。 采用苯：石 油醚 =1： 1 萃取液进行 GC 分析后，脂肪酸的峰值会更高，峰也比较标准。 前期处理后，将样品进行甲酯化，控制甲酯化的时间，也会对实验结果产生影响，通过比较实验，最终确定了实验的方案，为后续样品的检测分析提供了实验方法以及依据。 研究对大豆脂肪酸分析的前处理过过程进行了条件优化，以期为育种工作者进行材料筛选提供简便、准确的检测方法。 4 1 材料与方法 实验材料 植物材料 大豆成熟籽粒，品种分别为二粒黑豆、高作选 1 号、灌云海白花、黄大粒、龙川黄牛毛、东农 36 号、东山 6东山白马豆、二季早豆 合 丰 24 号、花绿黄豆、花色豆、化眉豆、淮阳春豆、黄豆、黄豆 合丰 3合龙油太、黑河一号、横峰乌豆、花黑虎、黄秆豆、黄脐、回茬小黄豆、冀豆 7 号、犍为泉水豆、剑格化林鸡窝豆、酱黄豆、金山茶禾未食豆、 821巴中田坎豆 ② 、白露豆、白毛豆、白毛早豆子、 77391大黑豆、大黑脐、大黄豆 大黄豆 大黄珠、大粒黑豆、大粒黄、大青仁、大天鹅蛋、大屯小黑豆、代米豆、丹徒小乌甲 主要仪器 万能粉碎机 sp100， Agilient6890N 型气相色谱仪， FFAP 弹性石英毛细管柱（ 50m ） 主要试剂 ： 脂肪酸标准品：软脂酸 ( Palmitic acid 分析纯＞ %) 、硬脂酸 ( Stearic acid 分析纯＞ 99%) 、油酸 ( Oleic acid 分析纯＞ 99%) 、亚油酸 ( Linoleic acid 分析纯＞ %)、 亚麻酸 ( Linolenicacid 分析纯＞ 99%) ，购于美国 SIGMA 公司； 正己烷 ( 色谱纯＞ %) ；甲醇 ( 分析纯＞ 99%) 、苯（分析纯＞ 99%）、石油醚 ( 分析纯＞ 99%)、氢氧化钠（分析＞ 99%）。 分别采用正己烷和苯：石油醚 =1： 1 对 5 种脂肪酸标准样品进行稀释至。 实验方法 甲酯化试剂的准备 取分析纯氢氧化钠 放入带磨口的棕色试剂瓶中，取 100ml 甲醇沿玻璃棒注入试剂瓶中，搅拌 3min，在室温反应 2h 后，待用， 4℃保存，可用 3d。 样品前期处理 将样品用万能粉碎机粉碎后，称取 豆粉样品于 的离心管中，加入1ml 正己烷，充分振荡 ，室温放置 5h。 5 脂肪提取及甲酯化 检测方法 ： 将供试材料用研磨仪充分研磨 ， 磨好后取 g 的豆粉放入 mL 离心管中 ， 加 1 mL 脂肪提取液 ， 振荡混匀 10 min， 离心后取上清 ， 加 1 mol/L 甲醇钠甲酯化 ， 静置 10 min， 加饱和 NaCl 溶液至样品分层。 吸取 1 μL 上清液进入气相色谱。 色谱条件 为了获得较好的分离效果、较高的灵敏度和理想的分辨率，分析前对不同的进样口压力、载气流速、程序升温条件等实验条件进行了优化。 最终确定了以下色谱条件。 色谱分析条件： 美国安捷伦公司 Agilent6890N 气相色谱仪， FFAP 弹性石英毛细柱（ 30m320μm），进样口为 Agilent 分流 /不分流进样口，进样口温度为 250℃ ， FID 检测器温度为 250℃ ，氮气流速 40ml/min，氢气流速 40ml/min，空气流速 450ml/min，分流比 20:1，样品进样量 1μl，程序升温：初始温度 80℃ ，25℃ /min 到 200℃ ，再以 3℃ /min 到 215℃ ，最后以 2℃ /min 到 230℃。 2 结果与分析 不同萃取溶剂对脂肪酸提取效果比较 到目前为止，脂肪酸的提取大部分采用采用 Folch[14]法或 Bligh 和 Dyer[15]法这两类比较经典的提取方法。 Folch 法是用 CHC13/CH3OH（ 2:1）的溶剂先将脂类从动植物组织中萃取出来，随带出的水形成一定组成的三元溶剂混合物。 CHCl3 相含脂类，水相含非脂溶性的物质。 这种方法几乎可把所有的脂类包括结合态脂从组织中提取出来。 但是 CHCl3 的毒性较大，还会引起一些副反应，所以人们还发展了许多其它的溶剂萃取系统。 如韩菊 [16]等人和 等 [17]人用二氯甲烷代替三氯甲烷萃取类脂，结果基本一致，而 CH2Cl2 的毒性小得多，更安全可靠。 常用的萃取溶剂还有苯，石油醚、正己烷、乙醚、正己烷 /异丙醇、正己烷：甲醇 (1:1， V/V)、乙醚乙醇 (1: 3， V/V)，苯：石油醚 (1:1， V/V)等。 考虑到试剂的毒性问题，本文采用了毒性相对较小的苯、石油醚和正己烷作溶剂，并对二者的提取效果进行了比较。 两种方法的色谱 6 图如图 1 和图 2 所示。 图 1 苯和石油醚做萃取剂提取大豆脂肪酸的气相色谱分析谱图 图 2 正己烷做萃取剂提取大豆脂肪酸的气相色谱分析谱图 结果显示，由苯、石油醚以及正己烷做溶剂提取脂肪酸，二者提取结果相差不大，苯和石油醚的混合物效果略好。 所以本实验对 50 个样品进行脂肪酸提取采用的是苯和石油醚作为脂肪酸的提取溶剂。 m in8 10 12 14 16 18 20 22 24pA2030405060708090100 F I D 1 A , ( 张学玲 1 3 0 5 0 6 \ 1 3 0 4 1 5 2 0 1 3 0 5 0 6 1 6 1 7 1 5 \ 0 2 6 F 0 6 0 1 . D ) 15.621 18.902 19.361 20.396 21.967m in8 10 12 14 16。