项目名称-量子点标记技术研究病毒侵染过程及宿主应答-首席科学家

项目名称-量子点标记技术研究病毒侵染过程及宿主应答-首席科学家内容摘要：

研究内容： 1) 基于宿主细胞膜磷脂 “自然嵌合 ”的囊膜病毒量子点标记 ：针对囊膜病毒在释放时从宿主细胞膜获取带磷脂的囊膜这一现象，提出一种普适、通用的量子点标记新策略：用磷脂衍生物（生物素化或炔基化磷脂）通过疏水相互作用自然嵌合进入宿主细胞膜；在病毒自复制过程中， 功能化磷脂衍生物自然进入病毒囊膜，然后用亲和素修饰的量子点通过亲合作用，或带有叠氮基的量子点通过 “Click chemistry”技术实现量子点对活病毒的标记，通过调控磷脂衍生物或量子点的用量，进行量子点标记的定量控制。 2) 针对病毒特定蛋白的定点量子点标记： 利用近年来发展起来的新的真核展示系统 —杆状病毒展示系统，在杆状病毒囊膜蛋白 gp64上融合表达一个 15个氨基酸的 APtag短肽，将其展示在囊膜蛋白 gp64蛋白表面。 APtag能在含BirA酶、 ATP、生物素的溶液中被生物素化，进而通过亲和素与生物素的强特异 性结合作用实现杆状病毒的量子点定点标记。 3) 活细胞内病毒和量子点的组装： 在前期病毒核衣壳蛋白与量子点胞外自组装及量子点活细胞合成的基础上，在活细胞内实现病毒组装与量子点合成的耦合，使病毒在复制组装过程中包装上量子点，实现活细胞内病毒与量子点的组装。 或者利用杆状病毒 Bac to Bac表达系统，构建能表达 EV71主要衣壳蛋白的重组杆状病毒，将量子点转染进 Sf21 细胞系，随后进行重组杆状病毒感染。 在感染细胞内，通过高效表达的病毒衣壳蛋白和量子点的结合将量子点包装于病毒衣壳内，形成类病毒样无囊膜病毒组装颗粒。 4) 基 于慢病毒载体系统的通用型囊膜病毒与量子点的包装： 模拟自然界慢病毒包装原理，将慢病毒包装信号 Ψ序列与量子点连接，与慢病毒包装质粒共转染宿主细胞，构建病毒囊膜蛋白、核衣壳蛋白与量子点上包装信号 Ψ序列相结合形成的具有侵染性的假病毒颗粒。 通过替换不同病毒囊膜的包装质粒，可组装成携有不同病毒囊膜蛋白包装量子点的假病毒粒子。 研究 目标： 实现量子点对不同结构病毒颗粒的定点或定量标记，争取实现单个量子点标记单颗活病毒的 “单对单 ”标记，发展普遍适用的量子点标记活病毒颗粒的技术和标记策略；分别针对囊膜病毒和非囊膜病毒，建立普 适性的量子点与病毒的可控组装方法；确保标记病毒和假病毒颗粒具有与野生病毒相当的侵染能力和侵染行为；为实时、动态地研究病毒侵染宿主过程提供标记技术平台。 课题 病毒侵染过程的 “时 空 ”诠释 课题负责人： 肖庚富（中国科学院 “百人计划 ”入选者） 承担单位： 中国科学院武汉病毒研究所、中国科学院长春应用化学研究所、武汉大学 经费比例： 24% 主要学术骨干：王宏达、张志凌、崔宗强、 刘义 病毒的侵染是病毒感染复制周期中至关重要的第一步，对其动态过程进行“时 空 ”诠释，将为阐明病毒感染的分子机制、设计阻断病毒侵染的新型药物提供科学依据。 以某些重要的医学病毒（如流感病毒、乙脑病毒等囊膜病毒，以及EV71等非囊膜病毒）及相关宿主为研究对象，基于课题 2发展的活病毒标记及病毒组装等技术， 结合高灵敏、高分辨多维动态显微成像技术，深入研究病毒与细胞质膜和细胞内膜系统相互结合的实时动态行为，揭示其跨膜转运的机制，示踪病毒胞内输运、病毒脱壳及核酸释放等动态过程，更深层次理解病毒入侵过程中在活细胞内的时 空分布 状况与运动规律。 本课题将主要开展以下研究： 研究内容： 1) 单病毒颗粒侵染宿主细胞的实时动态高分辨示踪技术 ：利用建立的病毒量子点荧光标记及组装技术，采用高灵敏、高分辨的活细胞荧光快速成像系统，在多维立体空间和时间尺度（ XYZt）上建立病毒侵染活细胞实时动态监测技术，实现单个病毒颗粒在活细胞内运动轨迹的高分辨示踪，定量获取病毒的动态参数（如病毒扩散系数、运动速率、定向运动步长等），研究单个病毒侵染的精细历程。 2) 病毒颗粒跨膜行为： 利用 TIRF、 FRET、高分辨荧光显微成像 或 原子力显微镜等技术，结合荧光蛋白标 记网格蛋白、小窝蛋白、浮艇蛋白、肌动蛋白和细胞囊泡等，以及 siRNA干扰等分子生物学技术，研究病毒囊膜或衣壳蛋白与细胞受体结合、受体介导病毒囊膜或衣壳蛋白变构、病毒插入细胞质膜的行为、量子点标记病毒招募网格蛋白及肌动蛋白转运病毒的精细行为，探索病毒跨越细胞质膜的分子机制。 3) 病毒颗粒胞内输运及核酸释放的动态行为： 研究病毒囊泡运输、在微管组织中心（ MTOC）集聚、胞内体质子泵（低 pH）和酸性水解酶诱发病毒－胞内体膜融合的动态行为；研究病毒进入溶酶体的动态过程，揭示其与细胞自噬（ Autophage）的关系。 利用量 子点等多色标记的病毒颗粒，研究病毒脱壳及核酸释放的动态过程。 4) 病毒在小动物体内的运动行为： 尝试 以小鼠等小动物为模型，对近红外量子点 或生物 标记病毒感染的活体进行荧光动态示踪，用光 磁多功能量子点标记病毒实现活体多模成像，并研究病毒在活体内的自然感染途径、运动方式和聚集部位。 研究 目标： 建立 单病毒颗粒侵染宿主细胞的高分辨示踪技术 ，实现 单个病毒的入侵行为的实时动态示踪 ；对 病毒的跨膜、囊泡输运、脱壳等 一系列重要过程进行 “时空 ”诠释，揭示某些关键过程的行为机制，在 单病毒颗粒示踪及侵染机制等研究方面取得具有自主知 识产权、领先于国际同类研究的创新性成果。 课题 量子点标记病毒的宿主应答 课题负责人： 黄承志（国家杰出青年科学基金获得者） 承担单位： 西南大学、深圳先进技术研究院、 中国科学院武汉病毒研究所 经费比例： 24% 主要学术骨干： 张治平 、 马轶凡、郑鹄志 、 杨用 病毒引发的宿主应答是机体对抗病毒感染的核心环节。 从认识的系统性角度出发，同时为了客观、科学地将纳米技术应用于生物学过程研究，也有必要研究宿主对量子点标记病毒的应答行为及机理。 本课题将主要开展以下研究： 研究内容： 1) 宿主细胞对量子点标记病毒颗粒的呈递途径 和应答行为： 以原代培养的宿主细胞或细胞系（组织细胞和抗原呈递细胞）为模型，研究量子点标记病毒引发的宿主细胞活化，及细胞因子和趋化因子分泌等宿主应答行为；探讨量子点标记对病毒引发宿主应答的影响；观察抗原呈递。