973项目申报书-植物免疫机制与作物抗病分子设计的重大基础理论

973项目申报书-植物免疫机制与作物抗病分子设计的重大基础理论内容摘要：

源 RNAs表达的影响。 7. 利用生物信息学方法对 Xoo侵染水稻获得的小 RNA 进行分类 ， 预测小 RNA的靶基因 ； mRNA 表达谱分析。 8. 鉴定及获得带有乙烯耐受基因的抗性水稻株系；分析在阻断乙烯反应后对稻瘟病菌的抗病 变化。 鉴定及获得组成性乙烯反应的水稻材料株系；分析在组成性乙烯发育水稻株系中，具有抗性或是具有感病性水稻对病 原 菌侵染的反应及病斑程度。 利用microarray 等技术，分析 OsNPR1 基因介导的 SAR 与生长素信号途径等之间1. 再分离鉴定 PTI途径基因 12个 及 ETI途径基因 12 个，并明确这些基因的功能。 再克隆病原菌效应蛋白基因 12个，并认识病原效应蛋白基因的功能，分离其植物体内的靶标基因 35 个；鉴定抗病蛋白复合体组份 23 个，明确植物 NBLRR类抗病蛋白分子间的相互作用及对其功能的影响；找到bir1, snc1, snc2, snc4， mkk1 mkk2 的抑制子基因 34 个。 2. 明确水稻 OsFLS2 对鞭毛蛋白的感知能力；获得涉及 2 个基因的变量表达的突变体株系；构建获得 2 个水稻病原菌诱导表达的 cDNA 文库。 3. 初步定位 12 个 SAR 突变体 ； 解析MEKK1 结合蛋 白 ； 初步建立鉴定 Pigm的抗病防卫反应基础信号网络体系。 4. 得到宿主作物细胞在禾谷镰孢侵染早期的动态转录组；揭示其与作物细胞本身能量、物质代谢途径交叉互作的结点 /关键分子。 5. 明确病毒 参与抗性 TGS 目标蛋白 靶基因 DNA 甲基化的作用三者互作关系和调控模式 ； 得到一整套针对水稻RNA干扰途径主要基因的稳定的 RNAi突变体株系。 6. 对 LPS 受体基因进行遗传和物理定位；构建候选 LPS 结合蛋白的水稻遗传学研究株系。 7. 分析乙烯反应被阻断后对水稻抗病性的影响及相关表型变化。 8. 鉴定与 RDV P2 蛋白互作的水稻蛋白并分析其可能的 生化功能。 9. 筛选并获得水稻 OsNPR1 基因调控的信号途径下游成分并对其进行遗传分析。 10. 完成 ROD 基因功能鉴定工作； 完成水稻抗白叶枯病基因（ QTL）的功能鉴定；获得 Pigm/ROD 的 supprosser 的稳定突变；定位克隆一个抗锈病 QTL； 11. 分别获得 410 个 xa5Xa21Pid2Pid3 或 Yr10Yr18Yr36 阳性的转基因株系 410 个。 12. 创建 PID Yr Yr18 或 Yr36 基因 研究内容 预期目标 具有 crosstalk 功能的候选基因。 9. ROD 基因功能的鉴定工作；水稻抗白叶枯病基因（ QTL）的功能鉴定工作；新广谱抗病基因（ QTL）的定位工作；抗锈病 QTL 的定位工作 ； 研究抗黄萎病相关基因。 对上年度获得的新型抗病等位基因（ PID Yr Yr18 和 Yr36 等 ），构建 自然表达 载体并 转化到 水稻或小麦 中； 小麦 EDR1 和 EDR2 同源基因 的功能验证。 10. 分别将 xa5Xa21Pid2Pid3 聚合载体和 Yr10Yr18Yr36 聚合载体导入水稻品种明恢系列或小麦品种济麦等系列。 11. 通过突变、剪切或重组，创建 PIDYr Yr18 或 Yr36 基因 的新型设计抗病基因 ； 水稻 Pigm 与 Pi9 基因重组位点的创建 ； 继续水稻 xa Xa2Pid2 和 Pid3 基因的回交转育 ； 利用基因标记，继续小麦 Yr Yr18 和Yr36 基因的回交转育。 的新型设计抗病基因 25 个。 13. 筛选 5 万个 F2 个体，获得 Pigm 和Pi9 重组的 F2 单株 23 株。 14. 发表 SCI 文章 1012 篇。 15. 申请专利 78 个。 第 三 年 1. PTI 通路新基因的生化和分子生物学分析 ； PRR 受体蛋白互作蛋白的功能鉴定。 2. Xoo 鞭毛蛋白 /解毒蛋白的糖基化分析及表型分析 ； 效应蛋白靶蛋白的分离鉴定 ； 抗病蛋白互作蛋白的筛选 ；抗病基因和无毒基因互作的分子机制研究。 3. 对 bir1, snc1, snc2, snc4, mkk1 mkk2这5 个突变体做进一步的抑制子筛选，克隆更多的基因 ； 利用图位克隆和全基因组测序技术筛选到 SAR 突变体的突变位点 ； MEKK1 结合蛋白及 FLS2介导的磷酸化蛋白的 功能验证。 水稻MAPK 突变体， RNAi 植株纯合及抗病分析。 4. 利用图位克隆的方法鉴定 spi 基因。 分析 LPS 结合蛋白和 LPS 受体在病原识别和植株发育过程中的功能。 5. 综合运用 各种生物手 段具体研究禾谷1. 认识 PTI 途径相关基因编码蛋白的生化和分子生物学特性 ； 明确 ETI 途径相关基因编码的抗病蛋白的生理生化特性 ； 明确病原菌效应蛋白靶标基因的功能及分子特性。 2. 克隆 12 个新的 bir1, snc1, snc2, 等的抑制子基因。 3. 明确 12 个 RLKs、 WRKYs 或 ERFs 在水稻抗病性中的作用；筛选获得一批与 RLK、 WRKY或 ERF互作的候选蛋白；初步确定 PTI 中受调控的基因。 4. 确定 12 个 SAR 突变体的突变位点 ；解析连接 MEKK1 与 PRR 受体 FLS2 的蛋白组份。 5. 克隆到 1 个 Pigm 的抑制子 spi。 6. 明确 35 个在宿主作物 禾谷镰孢互作中起作用的重要基因 ； 初步揭示活性EPS 寡聚体对宿主植物抵抗病源菌入侵的作用 ； 明确靶基因对病毒侵染的应答效应，及其参与的抗性途径机制 研究内容 预期目标 镰孢应答基因在植病互作中起重要作用 ； 用不同的 EPS 寡聚体处理宿主植物，接种病源菌，观察其侵染能力的变化。 6. 构建关键靶基因过表达和敲除突变体，并进行病毒侵染性的分析 ； 研究水稻 RNA 干扰途径对病毒侵染的抵抗作用 ； 实验验证小 RNA 与潜在靶标的调控关系；在水稻 dcl4 突变体中受Xoo诱导的水稻小 RNA 的表达是否依赖 dcl4 基 因。 7. 利用 RNAi和过表达方法对 SA 与生长素途径之间具有重要作用的基因进行分析，阐明其遗传学功能。 8. 继续 ROD 基因研究工作 ； 水稻抗白叶枯病基因（ QTL）的功能鉴定 ， 克隆 2个新的广谱抗病基因（ QTL ） ；Pigm/ROD 的 supprosser 突变基因的定位工作 ； 新的抗锈病 QTL 的定位；继续克隆抗黄萎病相关基因。 利用携带新型等位基因（ PID Yr Yr18 和Yr36 等 ）的转基因植株，确定转基因在受体基因组的整合和表达模式 ； 小麦 EDR1 和 EDR2 同源基因 的功能验证。 9. 评价 xa5Xa21Pid2Pid3 聚合载体对水稻白叶枯病和稻瘟病的 抗性特征；评价 Yr10Yr18Yr36 聚合载体对小麦条锈病的 抗性特征。 利用突变、剪切或重组等手段获得的新型 PIDYr Yr18 或 Yr36 基因，构建各自的自然表达 载体并转化到 水稻品种明恢系列或小麦品种济麦等系列 ； 水稻Pigm9 新位点的 功能评价。 10. 利用基因标记，继续水稻 xa Xa2Pid2 和 Pid3 基因的回交转育。 11. 利用基因标记，继续小麦 Yr Yr18 和 Yr36 基因的回交转育。 和调控作用。 7. 找出参与抗病毒的 水稻 关键的 RNA干扰途径的主要组份 ； 明确候选小RNA 的靶标基因，及 Xoo 诱导的水稻小 RNA 是否依赖 RNA 沉默途径。 8. 分析候选水稻 LPS 受体及结合蛋白的功能及在病原识别和发育调控中的分子功能。 9. 对乙烯途径与水稻抗稻瘟病反应中的关键基因进行功能分析。 10. 研究 P2 蛋白影响 GA合成途径的关键因子及影响机制。 11. 分析 OsNPR1 介导的 SA 与生长素途径之间的 crosstalk 及关键因子功能 ； 发表关 于 ROD 基因研究工作的论文 ； 发表水稻抗白叶枯病基因（ QTL）功能相关的论文 ； 克隆 2 个新的广谱抗病基因（ QTL） ； 克隆至少一个 Pigm/ROD的 supprosser 突变基因 ； 克隆一个新的抗锈病 QTL。 12. 确定 EDR1 和 EDR2 转基因在受体基因组的整合和表达模式；获得具有新型抗性特征的基因 12 个 ； 确定多基因聚合载体在受体基因组的整合和表达模式； 确定多基因聚合载体赋予受体植株的抗病特征。 13. 筛选 5 万个 F2 个体，获得 Pigm 和Pi9 重组的 F2 单株 23 株；获得Pigm9 位点纯合的单株 23 个。 14. 发 表 SCI 收录论文 1824 篇。 15. 申请专利 1012 项。 研究内容 预期目标 第 四 年 1. PTI 通路新基因在植物抗病途径信号传导途径中作用及位置分析； PRR 受体蛋白互作蛋白下游信号通路研究。 2. Xoo 鞭毛蛋白 /解毒蛋白作用及机制分析 ； 效应蛋白靶蛋白的功能分析 ；抗病蛋白互作蛋白的功能鉴定及分子生物学研究 ； 抗病基因和无毒基因互作的分子机制研究。 3. 荧光互补与免疫共沉淀研究 PTI 基因网络中至少 2 个蛋白间的相互作用；构建从酵母双杂交或免疫沉淀筛选到PTI 基因网络中的重要组分的过量表达与 RNAi 转基因植株，人工接种鉴定其抗病性。 4. 利用酵 母双杂及免疫共沉淀技术，寻找其他参与 R 蛋白下游传导的蛋白 及其他参与 SAR 下游传导的蛋白 ； 深入解析 MEKK1 结合蛋白、 FLS2 介导的磷酸化蛋白的功能。 水稻 MAPK 上下游蛋白元件分析。 5. 从蛋白生化反面分析 Pigm与 OsSGT1，BBI1， OsRAR1， OsNPR1 是否存在互作，结合遗传的数据，建立 Pigm 的基础抗病防卫反应网络。 6. 采用激光显微切割，基因组芯片等，揭示宿主作物细胞在活体 /半活体病原侵染早期的动态转录组； 通过分离、纯化获得活性寡聚体；应用分离到的活性 EPS 寡聚体处理拟南芥，接种丁香假单胞菌。 7. 进行病 毒侵染前后靶基因相关 siRNA northern blot、测序检测；靶基因 DNA甲基化测序、 Southern blot 检测和信息学分析；和上述在目标突变体的研究结果相比较，研究突变体和病毒侵染对靶基因甲基化改变的相关性 ； 根据第 13 年的研究结果进一步研究RNA 干扰的作用机理及其在抗病毒中的作用 ； 利用过表达人工 miRNA 等转基因方法对 23 个水稻小 RNA 介导的抗病反应进行验证。 8. 阐明 LPS 结合蛋白和 LPS 受体的信号转导途径及其与细菌表面分子相互作1. 明确 PTI 途径相关基因在植物 PTI 信号传导途径中的位置及作用； 明确ETI 途径相关基因编 码的抗病蛋白的下游靶标基因，确定其在 ETI 信号传导途径中的作用 ； 确定病原菌效应蛋白靶标基因的识别机制及其激活下游信号传导的途径及机制 ； 确定植物抗病蛋白抗病复合的组分，明确植物抗病蛋白的作用机制及信号传导机制 ；确定 R蛋白下游传导的蛋白与已知蛋白的关系 ； 明确水稻 PTI 途径中至少2 个关键组分间的互作关系；明确至少一个 PTI 中关键组分在植物免疫中的功能。 2. 找到 SAR 信号通路相关分子；确定新蛋白与已知蛋白的关系 ； 阐明一个完整的参与抗病的 MAPK 蛋白激酶级联。 3. 筛选验证 Pigm 互作蛋白。 4. 得到宿主作物细胞在活体 /半活体 病原侵染早期的动态转录组 ； 建立体外酶促产生苜蓿根瘤菌 EPS胞外寡聚体的技术方法。 5. 明确病毒侵染改变靶基因 siRNA 和DNA 甲基化是病毒干扰表观遗传途径的作用结果。 6. 获得具有潜在育种前景的水稻材料或株系 23 个。 7. 阐明 LPS受体及结合蛋白作用的功能机制，建立病原识别及生长发育调控之间的功能联系。 8. 进一步阐明乙烯在水稻抗稻瘟病中的功能及与产量性状之间的关系。 9. 阐明病毒侵染与植物 GA 信号途径之间的分子互作关系； 对 水稻 SA 途径及生长素途径之间发挥重要作用的信号基因及蛋白进行功能机制分析 ； 发表水稻抗白叶枯病基因（ QTL）的相关论文；完成新广谱抗病基因（ QTL）的功能鉴定；完成 Pigm/ROD 的suppross er 突变的功能鉴定；发表抗锈病 QTL 研究的相关论文。 10. 设计另外两套多基因聚合转化或 分子标记聚合育种的模式；获得高抗水稻 研究内容 预期目标 用的功能机制，。