本科毕业论文陈皮提取物中多甲氧基黄酮的分离分析方法研究

本科毕业论文陈皮提取物中多甲氧基黄酮的分离分析方法研究内容摘要：

小肠运动，对大鼠有明显的升压作用 ,而且有作用迅速、消除快的特点 [22]。 陈皮还含有多酚类、 果胶（含量 15%30%）、肌醇 [23]等类成分。 顾国明等 [24]从橘皮中首次得到麝香草酚和 β谷甾醇。 硅胶柱层析是实验室分离黄酮类化 合物常用的分离方法之一。 洗脱剂一般用甲醇和二氯甲烷的混合试剂，比例随着所分离的化合物的极性而随之变换，也可以用梯度洗脱的方法进行洗脱。 但当黄酮类化合物极性较大时，在反复硅胶柱层析的过程中样品损失会比较多，分离效果也常不够理想。 功能性食品的研究与开发是近年来食品领域的发展前沿，代表着 2l世纪食品的一种发展潮流。 新世纪人们对健康的意识变得越来越强对饮食的要求也越来越高，期待通过摄食一些有益于健康的食品或功能性食品来达到预防疾病或促进健康的作用。 黄酮类化合物具有抗氧化、抗过敏、 抗炎、抗菌、抗突变、抗肿瘤、保肝作用，保护心脑血管系统和抗病毒以及杀虫等广泛的生理活性，且毒性较低，还可以用作 6 食品、化妆品的天然添加剂，如甜味剂、抗氧化剂、食用色素等，市场前景广阔。 黄酮类化合物的研究开展较早，目前，市场上开发的黄酮类产品主要有功能食品、功能性食品添加剂、药物中间体等。 本课题运用各种现代提取技术、分离技术和精制方法，对陈皮 中的黄酮类活性成分进行分离与纯化。 一方面，分离纯化出黄酮单体化合物，为开发功能产品，以及新型、高效、具有自主知识产权的创新药物奠定一定的基础；另一方面，可充分利用和开发枳 实资源，增加其附加价值，提高其经济效益，有助于打开市场，带动地方经济发展。 2 材料与方法 与 试剂 试剂 原料：陈皮 试剂：无水乙醇，蒸馏水，三氯甲烷，石油醚，乙酸乙酯 ，色谱乙腈 仪器 GWX9623MBE电热鼓风干燥 上海博迅实业有限公司医疗设备厂 DZF6020MBE真空干燥箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂 2XZ1 型旋片式真空泵 临海市谭氏真空设备有限公司 CCA20 低温冷却水循环泵 巩义市予华仪器有限责任公司 RE52AA 旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂 SHZDⅢ循环水真空泵 巩义市予华仪器有限责任公司 DS5510DT超声波清洗器 上海生析超声仪器有限公司 ZF7 三用紫外分析仪 巩义市予华仪器有限责任公司 JY10002 电子天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司 Paratons Module 2695 高效液相 色谱仪 Waters 公司 机理 吸附柱层析是利用吸附剂对混合式样各组分的吸附力不同而使各组分分离。 当采用溶剂洗脱时，发生一系列吸附→解吸→再吸附→再解吸的过程，吸附力较强的组分，移动的距离小，后出柱；吸附力较弱的组分，移动的距离大，先出柱。 实验步骤 7 提取：取一定量乙醇水溶液与陈皮粉末，用乙醇提取橙皮中的物质，再将乙醇溶液过滤，将得到的溶液用 旋转蒸发仪蒸为稠状物。 萃取：将稠状物用适量的蒸馏水溶解，再加入萃取剂氯仿适量，猛烈震荡数分钟，静置一段时间，取下层液，蒸干 ，得 多黄酮 类 化合物提取物。 装柱：取 g黄酮类化合物提取物溶于少量三氯甲烷。 取一定量 200300 目的硅胶于烧杯中，加入适量石油醚，搅拌，以湿法装柱装入 6*30 层析柱中，再加入适量海沙，硅胶和海沙表面均要保持水平，待到石油醚液面到达海沙表面时，开始加入黄酮粗提取物溶液。 洗脱：待该溶液完全流入石油醚后，依次用 400 mL 浓度为 35%， 55%， 75%，85%， 95%的乙酸乙酯石油醚（即料液比为 1:2）进行洗脱，每 50 mL 装一瓶， 从第一瓶开始编号，依次为 1,2,3,4,5直到 95%的洗脱液不再下滴。 检测：将得到的固体物质用无水乙醇定溶至 25 mL，依次用 HPLC 进行 测定，记录数据。 称取 3 份 15 g陈皮粉末， 150 mL 无水乙醇 (即料液比为 1： 10)，分别用索式提取法，加热回流法，静置提取法提取，分别对提取液进行抽滤，并分别用 30 mL 原浓度的乙醇水溶液洗涤滤渣，合并滤液和洗涤液，用旋转蒸发仪蒸干，萃取，再蒸干，称量固体物质量。 称取 5 份 25 g陈皮粉末 ，分别加入 250 mL 浓度为 20％、 40％、 60%、 80％、100％ 的乙醇水溶液 (即料液比为 1： 10)，静置提取 24 h。 分别对提取液进行抽滤，并分别用 50 mL 原浓度的乙醇水溶液洗涤滤渣，合并滤液和洗涤液，用旋转蒸发仪蒸干，萃取，再蒸干，称量固体物质量。 称取 5 份 50 g陈皮粉末，分别加入 500 mL 无水乙醇 (即料液比为 l： 10)，分别静置提取 1 d， 2 d， 3 d， 4 d， 5 d。 分别对提取液进行抽滤，并分别用 100 mL 乙醇洗涤滤渣，合并滤液和洗涤液，用旋 转蒸发仪蒸干，萃取，再蒸干，称量固体物质量。 工作曲线 称取 20 mg 川陈皮素标准品，用无水乙醇定容至 50 mL 容量瓶中，配置成 8 mg/mL，记为 A 溶液。 分别取 A 溶液 5 mL， 10 mL， mL， mL 定容至 50 mL，50 mL， 50 mL， 25 mL，浓度即为 mg/mL， mg/mL， mg/mL， mg/mL，用 HPLC 进行定量检测，测定五组标准溶液吸收峰面积的线性关系。 3结果与讨论 方法对黄酮类化合物提取率结果与分析 本文研究不同方法提取方法对黄酮类化合物提取率的影响，其中 静置提取法提取出 g，加热回流提取法提取出 g，索式提取法提取出 g。 由数据可知索氏提取法提取的量是最大的，可是考虑到实际情况 ，索氏提取法和加热回流法都只能少量提取，但静置提取法可以大批量的提取， 运用于实际生产， 且索氏提取法和加热回流法相对静置提取法来说消耗的能源较多且存在安全隐患，再就是静置提取法的产量相对前两者差距不是太大，所以最终决定采用静置提取法提取。 醇浓度对黄酮类化合物提取率结果与分析 采用 20％、 40％、 60％、 80％、 100％的乙醇水溶液对枳实中的黄酮苷类化合物进行提取实验，研究提取液浓度对黄酮类化合物提取率的影响结果见图 2。 图 2 乙 醇浓度对黄酮类化合物提取率的影响 of alcoholconcentration on flavonoid glycosides extraction rate 由图可知 ， 20%与 40%提取液提取出的量差别不大，而 40%到 100%提取液的提取率变化较大，且依次递增， 5 个实验组中提取出的质量依次为 g， g， g， g， g，所以提取液浓度应当以 100%为最佳。 9 不同提取时间对 黄酮类化合物提取率的影响见图 3。 图 3 提取时间对黄酮 类化合物提取率的影响 of extraction time on flavonoid glycosides extraction rate 由图可 知， 在 5 个试验组中，浸提 5 d 提取率最大，为 g，此前 1 d 到 4 d的分别提取出是 g， g， g， g，总体变化趋势不大。 因为浸提 1 d到 4 d 的产量变化不大，只有 5 d 的突然加大到 g， 考虑到实际操 作 的效率问题，最后选择提取时间为 1 d。 将配制好的 mg/mL， mg/mL， mg/mL， mg/mL， mg/mL的川陈皮素标准品做检测，结果如表 1，图 4. 表 1 川陈皮素标准品检测结果 Standard test results of the nobiletin 浓度 (mg/mL) 保留时间（ min） 峰高（ mAU） 峰面积（ mAU*min） 10 图 4 川陈皮素标准 工作曲线 Nobiletin standard working curve 由图可以看出，川陈皮素标准溶液的曲线成线性关系，且经计算得线性方程为Y=， Y 为峰面积， X 为川陈皮素浓度。 用 5 种不同浓度的洗脱剂（ 乙酸乙酯与石油醚 组成）洗脱之后， 得到结果如图 5。 图 5 洗脱剂洗脱之后 所得 样品 After the eluent resulting sample 11 一共得到 37 组溶液，由洗脱过程中 得到的溶液的颜色 判断 1,2,3 组为装柱时留下的石油醚，所以不进行后期的讨论， 410 是浓度为 35%的洗脱剂洗脱所得溶液，1117 是浓度为 55%的洗脱剂洗脱所得溶液， 1824 时浓度为 75%的洗脱剂洗脱所得溶液， 2531 是浓度为 85%的洗脱剂洗脱所得溶液， 3237 是浓度为 95%的洗脱剂洗脱所得溶液。 所得溶液较理论值少了 3 瓶，可能原因有两点，一是实验过程中的一些实际操作问。