第十三章分子生物学技术

第十三章分子生物学技术内容摘要：

scp12 真核生物 酵母质粒 16 常用的质粒如 pUC19，多连接子 MCS。 插入外源基因片段长度约 10kb。 将外源基因插入到 MCS中，随质粒的表达而表达，增殖而扩增。 外源基因插入到 MCS后， β 半乳糖苷酶的活性丧失而不显兰色 白色菌落。 如果不插入外源基因，则产生兰色。 从而筛选阳性菌落。 EcoRI HindIII Ori复制起点 LacZ APR pUC19 17 （二） .λ 噬菌体 (λphage)  是一种可在体外包装的细菌病毒 ,可高效感染大肠杆菌 .λ 噬菌体 DNA是线状双链 DNA分子 ,全长约 50kb,每条链各带 12bp长的单链互补末端 粘末端 (COS序列 )。 进入宿主细胞后不久，COS序列碱基配对环化。  改建后的 λ 噬菌体发展了多种较大型的克隆载体，如： 18  置换 λ 载体 – 溶解途径 载体和外源 DNA整合到宿主菌 DNA中。 可克隆 23kb的外源 DNA。  插入 λ 载体 – 裂解途径 DNA在宿主细胞中复制，然后包装成噬菌体，裂解宿主，释放噬菌体。 可克隆 5kb的 cDNA。 19 裂解途径 20 （ 三） .粘粒 (cosmid vector) （ 30～ 40kb） 是将质粒和 λ 噬菌体改建的一种载体 .它含 COS序列 ,插入一小 plasmid –而得名Cosmid。 改建后的粘粒含有 λ 噬菌体的复制起点和 cos 末端。 全长 8kb。 大片段外源 DNA插入后，在体外包装进而被克隆。 可包装 30～ 45kb长的 DNA片段，多用于基因文库构建。 21 (四 ) 大片段 DNA克隆载体  人类和哺乳动物的基因组很大，甚至许多单个基因也相当大（如： DMD gene 2300kb） ，克隆分析就需要更大的基因载体。 如近年来构建的一些载体： BAC， PI， YAC等。 22 细菌人工染色体（ bacterial artificial chromosome,BAC）  优点：能携带大片段 DNA，约 300kb。 在每个细胞中，一个载体分子能繁殖多个拷贝，高产 DNA。  缺点：会出现插入片段在结构上的不稳定，导致克隆 DNA部分的缺失或重排。 为克服上述缺点，人们采用低拷贝数复制子载体，如， E coli中的 F因子。 此质。