第四章dna重组

第四章dna重组内容摘要：

合时，数千 RecA单体协同聚集在单链上，形成螺旋状纤丝 (helical filament)。 RecF、 RecO和 RecR蛋白调节 RecA纤丝的 RecA蛋白相对分子质量为 38000， 它与单链 DNA结合形成的螺旋纤丝每圈含六个单体 ， 螺旋直径 10nm， 碱基间距。 此 复合物可以与双链 DNA作用，部分解旋以便阅读碱基序列 ， 迅速扫掠寻找与单链互补的序列。 互补序列一旦被找到，双链进一步被解旋以 允许转换碱基配对，使单链与双链中的互补链配对 ，同源链被置换出来 (图 43)。 链的交换速度大约为 6 bp/s， 交换沿单链 5′→3′ 方向进行，直至交换终止，在此过程中由 RecA水解 ATP 图 43RecA蛋白介导的 DNA链交换模型 A:DNA链交换的侧面观 : DNA结合； DNA结合； ， 同源链被置换出来。 B:DNA链交换过程 RecA 任何部位的 单链 DNA都能借助 RecA蛋白 与同源双链 DNA进行链的交换。 单链 DNA可以由许多途径产生， RecBCD酶 是产生参与重组的 DNA单链 主要途径。 该酶的亚基分别由基因 recB、 recC和 recD编码。 Rec BCD酶具有 三种酶活性 ：① 依赖于 ATP的核酸 外切酶 活性，② 可被 ATP增强的核酸 内切酶 活性，③ ATP依赖的 解螺旋酶活性。 当 DNA分子断裂时，它即结合 在其 游离端 ，使 DNA双链 解旋并降解 ，解旋所需能量由 ATP水解供给。 及至酶移动到 chi位点 (5′ GCTGGTGG3′) ， 在其 3′侧 4～ 6个核苷酸处将链 切开 ，产生具有3′ 末端的 游离 单链。 随后单链可参与重组各步骤。 大肠杆菌基因组共有 1009个chi位点，分布在 DNA各部位，平均 5kb有一个， 由于 DNA分子具有螺旋结构，在持续进行链的交换时需要两 DNA分子发生旋转。 RecA能够介导 单链绕入 另一 DNA分子，并水解 ATP。 一旦 Holliday中间体形成 ，即由 RuvA和 RuvB蛋白促进 异源双链 的形成。 RuvA蛋白能够识别 Holliday联结体(junction)的 交叉点 ， RuvA四聚体结合其上形成四方平面的构象，使得分支点易于移动， RuvA还帮助 RuvB六聚体环结合在双链 DNA上，位于交叉点 上游。 RuvB是一种 解螺旋酶 ，通过水解 ATP而推动 分支移动 (图 44)。 RuvAB复合物的移动速度约为 10～ 20 bp/s。 同源重组最后由 RuvC将 Holliday联结体 切开 ，并由 DNA聚合酶和 DNA连接酶 进行 修复合成。 RuvC是一种 核酸内切酶 ，特异识别Holliday联结体并将其切开。 它识别不对称的四核苷酸 ATTG， 此序列因而成为切开 Holliday联结体的热点 ，并决定 图 44 Ruv AB复合物结合于 Holliday联结体的模型 结果是 片段重组 还是 拼接重组 ，即异源双链区两侧来自 同一分子 还是 不同分子。 相当于原核生物中与重组有关酶的对应物 也已在 真核生物 中发现。 在酿酒酵母中的 rad51基因与大肠杆菌 recA基因同源，二者的功能有关。 该基因突变造成双链断裂积累，并且无法形成正常的联会复合物，但此蛋白质不能在体外与单链 DNA形成纤丝，表明原核生物与真核生物的同源重组机制可能 有所不同 二、 特异位点重组 特异位点重组 广泛存在于各类细胞中 ， 起着 十分特殊 的作用 ， 彼此有很大的不同。 它们的作用包括某些 基因表达的调节 ，发育过程中程序性 DNA重排 ， 以及有些 病毒和质粒 DNA复制循环过程中发生的整合与切除等。 此过程往往发生在一个 特定的短的 (20～ 200 bp)DNA序列内 (重组位点 )， 并且有 特异的酶 (重组酶 )和 辅助 因子 对其 识别和作用。 特异位点重组的结果 决定于重组位点的 位置和方向。 如果重组位点以 相反方向 存在于同一 DNA分子上，重组结果发生 倒位。 重组位点以相同方向 存在于同一 DNA分子上，重组发生 切除 ；在不同分子上，重组发生 整合(图 45)。 图 45特异位点重组的结果依赖于重组位点的位置和方向重组位点以白箭头表示。 A 重组位点反方向位于同一DNA分子 ， 重组结果发生倒位。 B 重组位点同方向位于同一 DNA分子 ， 重组发生切除；位于不同分子 ， 重组发生整合 位点专一性重组最早是在 λ 噬菌体 的遗传学研究中发现的。 λDNA 通过 重组 整合到大肠杆菌染色体的 专一性位点上 ，转变成为 原噬菌体 DNA的非活性状态。 一般位点专一性重组都具有 λ 整合作用的两个基本特征 ： ① 交换是相互的和保存原 先 的 DNA， 是 典 型 的 保 守 性 重 组（ conservative rebination） ； ②它发生在噬菌体和细菌 DNA短同源序列 中的专一性核苷酸上 ， 在高等生物细胞中 ，最重要的例子是通过 一组前体序列的位点专一性重排 构建 多种多样的专一 抗体基因。 本节简要介绍噬菌体 DNA的整合与切除。 λ 噬菌体的整合与切除。