分子生物学实验experimentsofmolecularbiology

分子生物学实验experimentsofmolecularbiology内容摘要：

， 应注意以下事宜： ① 尽量简化操作步骤 ， 缩短提取过程 ， 以减少各种有害因素对核酸的破坏； ② 减少化学因素对核酸的降解 ， 为避免过酸 、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏 ， 操作多在pH410条件下进行； ③ 减少物理因素对核酸的破坏 ， 物理破坏因素主要是机械剪切力 ， 其次是高温。 ④ 防止核酸的生物降解 ， 细胞内或外界的各种核酸酶 （ DNA酶 、 RNA酶 ） 酶解核酸链中的磷酸二酯键 ， 直接破坏核酸的一级结构。 其中 DNA酶 ， 需要金属二价离子 Mg2+， Ca2+的激活 ， 使用金属二价离子螯合剂乙二胺四乙酸(EDTA)、 柠檬酸盐 ， 基本上可以抑制 DNA酶的活性。 而 RNA酶 ， 不但分布广泛 、 极易污染样品 ，而且耐高温 、 耐酸 、 耐碱 ， 不易失活 ， 所以生物降解是 RNA提取过程中的主要危害因素。 提取高质量基因组 DNA的主要用途： PCR扩增的模板 用于构建基因组文库 用于 Southern blot 杂交分析 二、真核细胞染色体 DNA的制备 真核细胞染色体 DNA的制备过程 1. 真核细胞的破碎 （ 1）物理方式 :超声波法、匀浆法、液氮破碎法、 Al2O3粉研磨法等。 这些物理操作均可导致 DNA链的断裂。 （ 2）为了获得大分子量的 DNA，一般采用蛋白酶 K和去污剂温和处理法。 2. 去除蛋白质 常用酚、氯仿抽提。 反复的抽提操作对 DNA链的机械剪切机会较多，所以有人使用高浓度甲酰胺解聚核蛋白联合透析的方法，可以获得200kb以上的 DNA片段，适用于粘粒 (cosmid)构建基因组文库。 根据不同的实验要求，可选择不同的实验方法制备真核细胞染色体 DNA。 ：一般采用 2倍体积乙醇沉淀 或用异丙醇（ ） ：一般采用 TE 三、 RNA的分离与纯化 真核细胞 RNA的制备 从细胞中分离 RNA的纯度与完整性对于许多分子生物学实验至关重要。 如 Northern blot及cDNA合成及体外翻译等实验的成败 ， 在很大程度上决定于 RNA的质量。 RNA主要由以下几类分子组成： rRNA(占 RNA总量的 80％ — 85％ )、 tRNA和核内小分子RNA(占 10％ 15％ )、 mRNA(占 1％～ 5％ )。 rRNA在总 RNA分子中含量最丰富 ， 由 28S、18S、 5S及 4S几类组成 ， 它们之间同源性大 ，分子量变化不大 ， 所以可根据它们的密度和分子大小 ， 通过密度梯度离心 ， 凝胶电泳或离子交换层析进行分离。 mRNA分子种类繁多 ， 分子量大小不均一 ， 在细胞中含量少 ， 绝大多数 mRNA分子 (除血红蛋白及有些组蛋白 mRNA以外 )， 均在 3’端存在 20250个多聚腺核苷酸 poly(A)。 利用此特征 ， 可很方便地从总 RNA中 ， 用寡聚 (dT)亲和层析柱分离mRNA。 mRNA分子群体编码细胞内所有的多肽和蛋白质 ， 而 mRNA是分子生物学的主要研究对象之一。 鉴定所提取总 RNA分子的质量 ， 可以通过琼脂糖电泳后观察是否有明显得28S、 18S条带来判断。 Total RNA isolated from Trichoderma reesei induced by different inducers 图 1. 木霉总 RNA的分离 1. 微晶纤维素 2. 天然稻草粉 RNA 分离的关键因素是尽量减少 RNA酶的污染。 如何创造一个无 RNase的环境。  极力避免外源 RNase的污染：主要来源于操作者的手 、 实验的器皿和试剂  尽力抑制内源性 RNase的活力：主要来源于样品中的组织细胞。 (1)操作者的手直接触摸之处 ， 毫无疑问会留下RNase， 说话带出的唾液也富含 RNase。 故整个操作过程中 ， 应戴口罩和手套。 (2)空气中飞尘携带的细菌 、 霉菌等微生物 ， 也是污染外源 RNase的一条途径 ， 所以操作过程应在比较洁净。