20xx版食品发酵与酿造工艺学课程实验指导书

20xx版食品发酵与酿造工艺学课程实验指导书内容摘要：

、 设备和材料 ：显微镜、手提高压灭菌锅、恒温培养箱、培养皿、 500ml三角瓶、接种针、小笼格、喷枪、小刀、带盖广口玻璃瓶、马铃薯葡萄糖琼脂培养基 (PDA)、无菌水、废物缸 等。 溶液或试剂： pH 值试纸（ 1～ 14）。 菌种和培养料：毛霉斜面菌种、豆腐坯、红曲米、面曲、甜酒酿、白酒、黄酒、食盐。 四 、 实验原理 豆腐乳是我国独特的传统发酵食品，是用豆腐发酵制成。 民间老法生产豆腐乳均为自然发酵，现代酿造厂多采用蛋白酶活性高的鲁氏毛霉或根霉发酵。 豆腐坯上接种毛霉，经过培养繁殖，分泌蛋白酶、淀粉酶、谷氨酰胺酶等复杂酶系，在长时间的发酵中与腌坯调料中的酶系、酵母、细菌等协同作用，使腐乳坯蛋白质缓慢水解，生成多种氨基酸，加之由微生物代谢产生的各种有机酸与醇类作用生成酯，形成细腻、鲜 香的豆腐乳特色。 五、实验流程与步骤 实验流程 ⑴ 毛霉斜面菌 种→ 扩大培养→孢子悬浮液 ↓ 豆腐→豆腐坯→接种→培养→晾花→加盐→腌坯→装瓶→后熟→成品 ⑵ 毛霉的分离 配制培养基→毛霉分离→观察菌落→显微镜检 ⑶ 豆腐乳的制备 悬液制备→接种孢子→培养与晾花→装瓶与压坯→装坛发酵→感官鉴定 实验步骤 ⑴ 毛霉的分离 ① 配制培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基 (PDA)，经配制、灭菌后倒平板备用。 ② 毛霉的分离：从长满毛霉菌丝的豆腐坯上取小块于 5ml 无菌水中，振摇，制成孢子悬液，用接种 环取该孢子悬液在 PDA 平板表面作划线分离，于 20℃培养 1～2d，以获取单菌落。 ③ 初步鉴定 Ⅰ： 菌落观察：呈白色棉絮状，菌丝发达。 Ⅱ： 显微镜检 ： 于载玻片上加 1滴石炭酸液，用解剖针从菌落边缘挑取少量菌丝于载玻片上，轻轻将菌丝体分开，加盖玻片，于显微镜下观察孢子囊、梗的着生 15 情况。 若无假根和匍匐菌丝或菌丝不发达，孢囊梗直接由菌丝长出，单生或分枝，则可初步确定为毛霉。 ⑵ 豆腐乳的制备 ①悬液制备 Ⅰ：毛霉菌种的扩繁：将毛霉菌种接入斜面培养基，于 25℃培养 2d；将斜面菌种转接到盛有种子培养基的三角瓶中，于 同样温度下培养至菌丝和孢子生长旺盛，备用。 Ⅱ：孢子悬液制备：于上述三角瓶中加入无菌水 200ml，用玻璃棒搅碎菌丝，用无菌双层纱布过滤，滤渣倒回三角瓶，再加 200ml无菌水洗涤 1次，合并滤液于第一次滤液中，装入喷枪贮液瓶中供接种使用。 ②接种孢子：用刀将豆腐坯划成 的块，将笼格经蒸汽消毒、冷却，用孢子悬液喷洒笼格内壁，然后把划块的豆腐坯均匀竖放在笼格内，块与块之间间隔 2cm。 再用喷枪向豆腐块上喷洒孢子悬液，使每块豆腐周身沾上孢子悬液。 ③培养与晾花：将放有接种豆腐坯的笼格放入 培养箱中，于 20℃左右下培养，培养 20h 后，每隔 6h 上下层调换一次，以更换新鲜空气，并观察毛霉生长情况。 44～ 48h 后，菌丝顶端已长出孢子囊，腐乳坯上毛霉呈棉花絮状，菌丝下垂，白色菌丝已包围住豆腐坯，此时将笼格取出，使热量和水分散失，坯迅速冷却，其目的是增加酶的作用，并使霉味散发，此操作在工艺上称为晾花。 ④装瓶与压坯：将冷至 20℃以下的坯块上互相依连的菌丝分开，用手指轻轻在每块表面揩涂一遍，使豆腐坯上形成一层皮衣，装入玻璃瓶内，边揩涂边沿瓶壁呈同心圆方式一层一层向内侧放，摆满一层稍用手压平，撒一层食盐，每 100 块豆腐坯用盐约 400g，使平均含盐量约为 16％，如此一层层铺满瓶。 下层食盐用量少，向上食盐逐层增多，腌制中盐分渗入毛坯，水分析出，为使上下层含盐均匀，腌坯3～ 4d 时需加盐水淹没坯面，称之为压坯。 腌坯周期冬季 13d，夏季 8d。 ⑤装坛发酵 Ⅰ：红方：按每 100 块坯用红曲米 32g、面曲 28g、甜酒酿 1kg 的比例配制染坯红曲卤和装瓶红曲卤。 先用 200g 甜酒酿浸泡红曲米和面曲 2d，研磨细，再加 200g甜酒酿调匀即为染坯红曲卤。 将腌坯沥干，待坯块稍有收缩后，放在染坯红曲卤内，六面染红，装入经预先消毒的玻瓶中。 再 将剩余的红曲卤用剩余的 600g 甜酒酿兑稀，灌入瓶内，淹没腐乳，并加适量面盐和 50 度白酒，加盖密封，在常温下贮藏 6个月成熟。 Ⅱ：白方：将腌坯沥干，待坯块稍有收缩后，将按甜酒酿 kg、黄酒 1 kg、白酒 、盐 的配方配制的汤料注入瓶中，淹没腐乳，加盖密封，在常温下贮藏 2～ 4个月成熟。 ⑥质量鉴定 将成熟的腐乳开瓶，进行感官质量鉴定、评价。 六、 实验 注意事项 将放有接种豆腐坯的笼格放入培养箱中，于 20℃左右下培养，培养 20h 后，每隔 6h上下层调换一次，以更换新鲜空气。 在显微镜 下鉴定毛霉：注意观察孢子囊、梗的着生情况，若无假根和匍匐菌丝或菌丝不发达，孢囊梗直接由菌丝长出，单生或分枝，则可初步确定为毛霉。 注意 压坯：为使上下层含盐均匀，腌坯 3～ 4d 时需加盐水淹没坯面。 注意无菌操作。 16 七、实验作业与思考题 实验作业 ⑴ 从腐乳的表面及断面色泽、组织形态 (块形、质地 )、滋味及气味、有无杂质等方面综合评价腐乳质量。 实验思考题 ⑴腐乳生产主要采用何种微生物 ? ⑵腐乳生产发酵原理是什么 ? ⑶试分析腌坯时所用食盐含量对腐乳质量有何影响 ? 17 实验 六 酱油种曲孢子数及发芽率的测定 一 、 目的和要求 掌握应用血球计数板测定孢子数方法。 学习孢子发芽率的测定方法。 二 、 实验内容 酱油种曲孢子数测定法 孢子发芽率测定法 三 、 仪器 、 设备和材料 ：电子天平、显微镜、手提高压灭菌锅、恒温培养箱、培养皿、盖玻片、旋涡均匀器、血球计数板、废物缸等。 ： 95％酒精、稀硫酸 (1： 10)、 pH 值试纸（ 114）。 : 酱油种曲。 四 、 实验原理 酱油种曲孢子数 测定法 种曲是成曲的曲种，是保 证成曲的关键，是酿制优质酱油的基础。 种曲质量要求之一是含有足够的孢子数量，必须达到 6 109／ g(干基计 )以上，孢子旺盛、活力强、发芽率达 85％以上，所以孢子数及其发芽率的测定是种曲质量控制的重要手段。 测定孢子数方法有多种，本实验采用血球计数板在显微镜下直接计数，这是一种常用的细胞计数方法。 此法是将孢子悬浮液放在血球计数板与盖片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。 由于计数室中的容积是一定的，所以可以根据在显微镜下观察到的孢子数目来计算单位体积的孢子总数。 实验中，称样时要尽量防止孢子的飞扬。 测定时，如果发现 有许多孢子集结成团或成堆，说明样品稀释未能符合操作要求，因此必须重新称重、振摇、稀释。 生产实践中应用时，种曲通常以干物质计算。 种曲孢子发芽率的测定 测定孢子发芽率的方法常有液体培养法和玻片培养法，部颁标准采用玻片培养法。 本实验应用液体培养法制片在显微镜下直接观察测定孢子发芽率。 孢子发芽率除受孢子本身活力影响外，培养基种类、培养温度、通气状况等因素也会直接影响到测定的结果。 所以测定孢子发芽率时，要求选用固定的培养基和培养条件，才能准确反映其真实活力。 五、实验流程与步骤 实验流程 ①酱油种曲孢子数 测 定 法 曲种→称量→稀释→过滤→定容→制计数板→观察计数→计算 ②种曲孢子发芽率的测定方法 种曲孢子粉→接种→恒温培养→制标本片→镜检→计数 实验步骤 ㈠酱油种曲孢子数 测定法 ⑴ 样品稀释：精确称取种曲 1g(称准至 )，倒入盛有玻璃珠的 250ml 三角瓶内，加入 95％酒精 5ml、无菌水 20ml、稀硫酸 (1:l0)l0ml，在旋涡均匀器上充分振摇，使种曲孢子分散，然后用 3层纱布过滤，用无菌水反复冲洗，务使滤渣不 18 含孢子，最后稀释至 500ml。 ⑵制计数板：取洁净干燥的血球计数板盖上盖玻片，用无菌滴管取 孢子稀释液1 小滴，滴于盖玻片的边缘处 (不宜过多 )，让滴液自行渗入计数室中，注意不可有气泡产生。 若有多余液滴，可用吸水纸吸干，静止 5min，待孢子沉降。 ⑶观察计数 ①观察：用低倍镜头和高倍镜头观察，由于稀释液中的孢子在血球计数板上处于不同的空间位置，要在不同的焦距下才能看到，因而计数时必须逐格调动微调螺旋，才能不使之遗漏，如孢子位于格的线上，数上线不数下线，数左线不数右线。 ②计数：使用 16～ 25规格的计数板时，只计板上 4个角上的 4个中格 (即 100个小格 )，如果使用 25～ 16 规格的计数板，除计 4 个角上的 4 个中格外，还需要计中央一个中格的数目 (即 80 个小格 )。 每个样品重复观察计数不少于 2 次，然后取其平均值 ⑷计算 ① 16 25 的计数板 孢子数 (1／ g)＝ (N／ 100) 400X10 000 (V／ G)＝ 4X104 (NV／ G) （ 式中： N为 100 小格内孢子总数； V 为孢子稀释液体， ml； G为样品质量， g） ② 25 16 的计数板 孢子数 (1／ g)＝ (N／ 80) 400 10 000 (V／ G)＝ 5X104 (NV／ G) （ 式中： N为 80 小格内孢子总数； V为孢子稀释液体积， ml； G为样品质量， g） ㈡种曲孢子发芽 率的测定方法 ⑴接种：用接种环挑取种曲少许接入含察氏液体培养基的三角瓶中，置于 30℃下摇床振荡恒温培养 3～ 5h。 ⑵制片：用无菌滴管取上述培养液于载玻片上滴一滴，盖上盖玻片，注意不可产生气泡。 ⑶镜检：将标本片直接放在高倍镜下观察发芽情况，标本片至少同时做 2个，连续观察 2次以上，取平均值，每次观察不少于 100 个孢子发芽情况。 ⑷计算 发芽率＝ A／ (A+B) 100％ （式中： A为发芽孢子数； B为未发芽孢子数） 六、 实验 注意事项 酱油种曲孢子数 测定 采用血球计数板在显微镜下直接计数测定时，如果发现有许多孢子 集结成团或成堆，说明样品稀释未能符合操作要求，因此必须重新称重、振摇、稀释。 生产实践中应用时，种曲通常以干物质计算。 酱油种曲孢子数 测定 制计数板时，滴于盖玻片的边缘处 (不宜过多 )，让滴液自行渗入计数室中，注意不可有气泡产生。 若有多余液滴，可用吸水纸吸干，静止 5min，待孢子沉降。 应用液体培养法制片在显微镜下直接观察测定孢子发芽率，培养前要检查调整孢子接入量，以每个视野含孢子数 10～ 20 个为宜。 孢子发芽率除受孢子本身活力影响外，培养基种类、培养温度、通气状况等因素也会直接影响到测定的结果。 所以 测定孢子发芽率时，要求选用固定的培养基和培养条件，才能准确反映其真实活力。 种曲孢子发芽率的测定制片 时， 用无菌滴管取上述培养液于载玻片上滴一滴，盖上盖玻片，注意不可产生气泡。 注意无菌操作。 19 七、实验作业与思考题 实验作业 ⑴ 样品稀释至每个小格所含孢子数在 10 个以内较适宜，过多不易计数，应进行稀释调整。 结果记入表。 ⑵ 正确区分孢子的发芽和不发芽状态。 结果记入表。 实验思考题 ⑴ 用血球计数板测定孢子数有什么优缺点 ? ⑵ 影响孢子发芽率的因素有哪些 ?哪些实验步骤容易造成结果误差 ? 20 实验 七 大分子物质的水解试验 一 、 目的和要求 证明不同微生物有着不同的酶系，且对各种有机大分子的水解能力不同。 二 、 实验内容 证明不同微生物对各种有机大分子的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同酶系统。 掌握进行微生物大分子水解试验的原理和方法。 三 、 仪器 、 设备和材料 仪器或其他用具：净化工作台、恒温培养箱、无菌平板、无菌试管、无菌水、接种环、接种针、镊子、酒精灯、火柴、玻棒、试管架、记号笔、牛皮纸、棉绳、废物缸。 灭菌玻璃涂棒，灭菌吸管等。 溶液 或试剂：革兰氏染色用卢戈氏碘液 菌种： 枯草芽胞杆菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，普通变形杆菌 (Proteus vularis)。 培养基：固体油脂培养基，固体淀粉培养基，明胶培养基试管，石蕊牛奶试管 培养基 ，尿素琼脂试管 培养基。 四 、 实验原理 微生物对大分子的淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用，必须靠产生的胞外酶将大分子物质分解才能被微生物吸收利用。 胞外酶主要为水解酶，通过加水裂解大的物质为较小的化合物，使其能被运输至细胞内。 如淀粉酶水解淀粉为小 分子的糊精、双糖和单糖；脂肪酶水解脂肪为甘油和脂肪酸；蛋白酶水解蛋白质为氨基酸等。 这些过程均可通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实：淀粉遇碘液会产生蓝色，但细菌水解淀粉的区域，用碘测定不再产生蓝色，表明细菌产生淀粉酶。 脂肪水解后产生脂肪酸可改变培养基的 pH，使 pH 降低，加入培养基的中性红指示剂会使培养基从淡红色变为深红色，说明胞外存在着脂肪酶。 微生物可以利用各种蛋白质和氨基酸作为氮。