第十三章生物技术在植物育种中的应用

第十三章生物技术在植物育种中的应用内容摘要：

变异指植物组织和体细胞培养物在培养过程中产生的变异。 Larkin等（ 1981）在其综述文章中开始使用“体细胞克隆变异”（ somaclonal variation）这一概念。 为了区分来源于体细胞和单倍体细胞的变异， Evans将 来自配子体组织的变异称为“配子体克隆变异”（ gametoclonal variation），以与体细胞克隆变异区分开。 对于遗传变异的分析而言， Orton为了统一术语，引进了 R0、 R R2等，分别表示再生 当代、自交第一代、第二代等，至今这一概念还在广泛应用。 体细胞克隆变异的遗传基础 （ 1）染色体数目变异 最多见的是多倍体，主要是培养基中使用了细胞分裂素。 变异的大小与培养状态、年龄、原始材料的倍性及培养时期有关。 研究发现：二倍体变异的频率随培养时间的延长而降低，四倍体变异的频率却随培养时间的延长而增加。 （ 2）染色体结构变异 染色体结构变异似乎是体细胞克隆变异的主要来源，最重要的是染色体缺失、倒位、重复和异位。 很多体细胞再生株减数分裂时形成多价体、染色体桥、小片段、环等，充分说明了染色体结构变异的存在。 （ 3）点突变 这类突变可分为多种类型，一种类型是 自发突变 ，最早证实点突变存在的是从烟草中利用体外筛选获得抗chlorsulfuron的突变体。 很多通过细胞筛选获得的抗病、抗除草剂等突变体属于此类。 另一种点突变是诱发突变，培养基中加入化学诱变剂或进行诱变处理。 由于培养过程中，培养物一直处于诱变的环境条件下，所以突变究竟是 自发 还是 诱发 很难搞清楚。 第三种点突变是 基因的表达及基因放大或衰减。 高等植物的某些基因在发育过程中受到某一环境刺激，可以 放大自己，即基因的拷贝数大量增加 ，这意味着该基因转录的mRNA及蛋白质增加。 最初在动物细胞培养中发现这一现象，后来在植物中发现也存在。 比如，对某一物质的抗性，可以通过逐步增加浓度的办法而使细胞对该物质的抗性提高很多倍，这就是基因放大系统存在的很好例证。 同样，也发现植物细胞 DNA的丢失（衰减）， 如大豆悬浮系经过较长时间的培养，其核糖体基因丢失了 1/3。 第四种点突变是有丝分裂交换。 这种交换尽管很微弱地改变了基因的顺序，但仍影响基因的表达。 这种变化包括：某一基因拷贝的丢失，某一基因拷贝的重复或修复过程中基因的转变。 转座因子也是造成体细胞突变的原因之一，转座子通过插入与解离使某些基因的表达受到调控。 最后细胞质基因叶绿体和线粒体基因也能发生突变。 Gengenbach et al（ 1975）利用玉米 T小种毒素筛选获得了抗 T小种的细胞系，这个基因已知位于胞质中。 离体培养细胞会产生各种类型的突变体，除抗性突变体外，还有形态性状突变体、不育性、产量和品质性状的改变等。 形态变异如矮化性、叶型等，利用这些变异可以进行高光效育种。 培养再生植株中出现不育性的频率较高，但大多为核基因的突变，可以用来培育不育系。 产量和品质的突变必须在田间通过适当的分析才能确定。 实验室内细胞水平的突变体筛选多数在抗性突变体方面开展工作，如抗病、耐盐、抗重金属等。 突变体的筛选 为了增加突变频率，需要进行诱变处理。 将外植体、愈伤或悬浮系用诱变剂处理，如使用化学诱变剂，要充分洗涤后再进入下一步的工作。 使用多大剂量和处理多长时间才能达到较好诱变效果，应根据具体试验确定。 在突变体筛选中常采用两种选择法，即一步筛选法和多步筛选法。 一步筛选法是 将培养物接种在含有最低全部致死剂量的培养基上 ，表现出生长的培养物再转移到含有抑制剂的新鲜培养基上。 可以看出，这种方法是一次就把筛选压设定很高 ，使不抗细胞（野生细胞）完全不可能生长，筛选出的能生长的细胞即为耐（抗）性细胞系。 但在有些情况下这种方法不一定实用，有的细胞在超过最低全部致死浓度时，细胞均死亡，或单个细胞不能生存。 多步筛选法是首先使用半致死剂量对细胞进行筛选，每次继代将上代能生长的细胞系继代到筛选剂浓度提高的新鲜培养基上。 在这种筛选体制下，抗性细胞应该比野生细胞长的快，通过逐步增加筛选剂水平，最终会筛选出在抑制剂超过最低全部致死浓度时也能旺盛生长的细胞系。 但是，去除抑制剂后，抗性培养物的稳定性是常出现的一个问题，抗性丢失来自很多原因，包括细胞对抑制剂的生理适应。 可见，多步筛选易获得在某一抑制剂水平下，细胞稳定生长的细胞系。 筛选的材料对象可以是原生质体、愈伤块、悬浮培养物和花粉 /小孢子培养物。 利用原生质体进行抗性筛选有一大优点：筛选出的克隆极有可能来自单细胞，但是操作困难。 利用愈伤块筛选是最简单的方法，但这种筛选存在一定缺陷，愈伤块里的各个细胞不能均等地接触抑制剂，下部愈伤细胞比上部细胞吸收到较多的抑制剂，这样就使筛选结果在一定程度上失去可靠性。 悬浮细胞筛选也很常用，细胞接触选择剂较均匀，但存在一定的操作复杂性。 花粉/小孢子培养物用于突变体筛选有一定优势，突变体很容易表现出来，也很易纯合。 在作物改良上的应用 利用上述方法便可筛选体细胞克隆变异，将这一技术应用于作物改良技术路线见图。 优良品种 ↓ 细胞培养 R0 ↓ R1群体 ↓ 改良的体细胞克隆 确定遗传方式 ↓ 田间实验 遗传稳定性测试 ↓ 多点田间实验 育成新品系 ↓ 继续田间实验，种子富集 区域试验 ↓ 审 定 ↓ 投入生产 图 利用体细胞克隆变异育种的技术路线 （二） 单倍体细胞培养及育种利用 单倍体细胞培养在遗传和育种中的应用价值 花药培养（ anther culture）是指在获得单倍体的一种技术，之后，花粉和小孢子培养逐渐获得成功，从而使单倍体细胞培养体系更加完善。 单倍体在遗传和育种研究中有如下优点： （ 1）后代的快速纯合 通过单倍体迅速产生纯系。 在异花授粉作物中，可用单倍体产生加倍单倍体（ DH系），从中筛选纯合自交系用于杂交制种。 由于加速纯合，从而就缩短了育种周期（图）。 母本 父本 ↓ F1→ 花药培养 ↓ ↓ F2 花粉植株 ↓ ↓ ↓ 加倍 ↓ ↓ 品系比较试验 ← 选择鉴定 ↓ 区域试验 图 杂交育种与单倍体育种的周期比较 （ 2）提高选择效率 如果某一性状受一对基因控制，在 AA aa F2中，纯合AA个体只有 1/4。 如 F1采用花药或花粉培养，产生的后代中 AA个体占 1/2，比常规杂交育种提高一倍。 （ 3）排除杂种优势对后代选择的干扰 对于杂交育种来讲，由于低世代很多基因位点尚处于杂合状态，会有不同程度的杂种优势表现，对个体的选择会造成一定误差。 采用 DH群体进行选择育种，由于各基因位点在理论上均处于纯合状态，选择到的变异能更大程度上代表真实变异。 （ 4）遗传研究的良好材料体系 单倍体是基因互作检测、遗传变异估 计、连锁群构建、 QTL估计及定位等数量遗传学的良好材料。 尤其是近代分子生物学的发展， DH系成为分子标记作图的良好群体，它在一定程度上成为一种永久 BC或 F2群体。 （ 5） 突变体的筛选 由于单倍体的各基因均处于纯合状态，突变体很容易表现出来，从而大大提高了抗性或其它突变体的筛选效率，利用这一体系获得各种突变体的事例已很多，这里就不一一赘述。 离体培养条件下的小孢子发育 小孢子母细胞经减数分裂形成四分体小孢子，然后经单核早期、单核靠边期、双核期（一个营养核和一个生殖核），最后到达三核期而成为成熟花粉粒。 在离体培养条件下，花粉的正常发育途径受到抑制。 影响花药培养的因素 （ 1）供体植株的生长条件 供体植株的生长条件对培养效果有重要影响，有时只有在控温、一定光周期和光强的条件下，其花药才能有反应。 环境条件对于不同的植物种有很大不同，所以没有一个固定的环境控制模式。 （ 2 ） 供体植株的年龄 供体植株对培养效果也有一定影响，一般讲，开花初期植株的花蕾易于培养。 （ 3）花粉发育时期 用于培养的花蕾，其花药内小孢子发育时期对培养效果有较大影响，但因物种而异。 在烟草中，处于第一次有丝分裂期的花粉效果最好，而在禾本科和芸苔属中，单核早期最好。 （ 4） 花蕾和花药的预处理 对于有些物种，培养前对花药和花蕾进行预处理，能显著提高培养效果。 如大麦花药， 4℃ 处理 28d，或 7℃ 处理 14d，能收到最好效果。 可对整穗、小穗、甚至分离的花药施加预处理，只要注意处理期间不要与水接触。 也有人将花药接种后放在低温下预处理，不同材料需不同的预处理方式，没有一个固定模式。 （ 5）培养基 究竟使用固体或液体培养基应根据培养材料的要求定。 多数情况下，MS、 N6及马铃薯提取液培养基在禾谷类作物中用的较多。 花药培养时往往需要一定的渗透压，有的要求低浓度的蔗糖（ 2%~4%），有的要求高浓度的蔗糖（ 8%~12%）。 二细胞结构的成熟花粉往往需低浓度糖，而三细胞结构的成熟花粉植物往往需高渗条件，如油菜小孢子培养时，糖的浓度可用到13%~17%。 培养基中所添加的维生素和激素对培养效果可产生重要影响。 对于某些植物种来讲，添加某种植物的提取物或椰汁可以改善培养效果。 （ 6）培养条件 多数植物在 25℃ 下培养能诱导愈伤组织，可某些植物，尤其是芸苔属，在高温 35℃ 下处理几天，然后进入 25℃培养能收到最好效果。 花药培养一般在暗处进行，直到愈伤或胚状体形成再转到光下培养。 此外，接种花药的外植体置向、培养密度等有时对培养效果也有影响。 花粉（小孢子）培养 花粉培养是指把花粉从花药中分离出来，以单个花粉粒作为外植体进行离体培养的技术。 其优点在于花粉已是单倍体细胞，诱发后经愈伤组织或胚状体发育成的小植株都是单倍体植株或双单倍体，不含药壁、花丝、药隔等体细胞组织的干扰而形成的体细胞植株，但它的培养难度大。 单倍体诱导中存在的问题 对于多数植物来讲，能形成有活力胚的花药百分率很低，除此之外，还有很多问题存在。 通常花药或花粉离体培养时没有生长和发育迹象，或刚开始生长便导致胚败育；在产生单倍体的同时产生二倍体或四倍体；培养中我们需要小孢子分裂，而二倍体组织不分裂，但这种情况往往难以办到；白化苗难以避免，尤其是在禾本科作物中；在混倍性的材料中很难分离出单倍体，因为单倍体细胞的生长很易被生长旺盛的多倍体细胞所掩盖。 单倍体细胞培养与植物育种 单倍体是高度不育的，需要进行加倍处理才能应用。 秋水仙素是常用的染色体加倍药剂，可以用 1%的秋水仙素对正处于对数生长期的悬浮细胞进行处理，一般 24h左右。 也可在固体培养基中加适当浓度的秋水仙素。 花粉植株在培养过程中可以自然加倍，但频率很低。 将单倍体植株的组织或器官用作外植体，重新诱导愈伤组织，让培养细胞在培养过程中自然加倍也。