第三章荧光分光光度法

第三章荧光分光光度法内容摘要：

不呈线性关系。 （ 2） 溶剂的影响 一般来说，随着溶剂介电常数的增大， 荧光峰的波长越大，荧光效率也越大。 在 含有重原子的溶剂（ 例如 ：碘乙烷 CH3CH2I 和四溴化碳 CBr4） 中，也是由于重 原子效应，增加系间窜跃速度，会使荧光减 弱、磷光则相应增强。 溶剂中杂质的荧光光谱或溶剂的拉曼光 谱可能干扰测定。 若拉曼光处于荧光波长中，则产生干扰。 消除干扰的方法有： （ a）选用高分辨的仪器。 （ b）对纯溶剂的拉曼峰进行测定，然后在 荧光光谱 中进行校正。 （ 3） 温度的影响 大多数荧光物质都随其所在溶液的温度 升高荧光效率下降，荧光强度减小。 显然随着溶液温度升高，会增加分子间 碰撞 的次数，促进分子内能的转化，从而导 致荧光强度下降。 为此在许多荧光计的液槽 上配有低温装置，以提高灵敏度。 （ 4） pH的影响 当荧光物质为弱酸或弱碱时，溶液 pH的 改变对溶液的荧光强度有很大的影响，这是 因为它们的分子和它们的离子在电子构型上 的差异。 （ 5） 荧光的熄灭 荧光分子与溶剂分子或其它溶质分子的 相互作用引起荧光强度降低的现象称为荧光 熄灭。 这些引起荧光强度降低的物质称为 熄 灭剂。 引起溶液中荧光熄灭的原因很多，机理 也很复杂。 下面讨论几种导致荧光熄灭作用 的主要类型。 （ a） 碰撞熄灭 碰撞熄灭是荧光熄灭的主要原因。 它是指处于单重激发态的荧光分子 M*与 熄灭剂 Q发生碰撞后，使激发态分子以无辐 射跃迁方式回到基态，因而产生熄灭作用。 碰撞熄灭的定量方程： F0/F1=k [Q] 上式称为 SternVolmer方程式。 式中： k为熄灭常数； [Q]为熄灭剂浓度， 单位 mol/L； F0、 F分别为熄灭剂不存在时和 存在时，溶液的荧光强度。 ） k与体系的粘度有关系，粘度越大， k越 小； ） k与体系的温度有关系，温度升高， k也 升高；温度每升高 1C， k值增加在 2%以下； ）熄灭剂的浓度 [Q]不得大于 10mol/L。 （ b） 组成化合物的熄灭 有 些荧光熄灭现象不能用碰撞熄灭理论 来解释。 例如 ：某些荧光物质溶液在加入一些熄 灭剂之后， （ *） 溶液的吸收光谱有了显著的 改变 ，（ *） 溶液的荧光强度 显著 降低。 又如 ：某些荧光物质的溶液在加入熄灭 剂之后，它的荧光强度随着温度的升高而增 强。 以上几种情况都是因为组成化合物熄灭 所致。 上述情况可能是： 络合 M（有荧光） +Q  MQ（无荧光） 分解 T， MQ  M+Q （荧光增强） 如果 MQ的形成是由于强大的力，则 MQ 将具有它自己的特征吸 收，因此溶液的吸收 光谱也发生了改变。 （ c） 转入三重线态（级）的熄灭 含溴化合物、碘化合物、硝基化合物、 重氮化合物 、羰基化合物、羧基化合物及某 些杂环化合物，容易转入三重线级，溶液中 绝大部分转入三重线级的分子在一般温度下 不发光，它们将多余的能量消耗于它们与其 它分子的碰撞之中，因而引起荧光熄灭。 溶液中的 溶解氧 常对荧光产生熄灭作用。 这可能是由于顺磁性的氧分子与处于单重激 发态的荧光物质分子相作用，促进形成顺磁 性的三重态荧光分子，即加速系间窜跃所致。 实验证明 ： O2的熄灭作用，似乎是随溶 剂的介电常数的减小而增加，所以 O2在水溶 液中熄灭作用 较小，而在有机溶剂中熄灭作 用较强。 （ d） 发生电子转移反应的熄灭 某些熄灭剂分子与荧光物质的分子相互 作用时，发生了电子转移的反应，即氧化 还原反应，因而引起荧光的熄灭。 例如 ：甲基兰荧光溶液被 Fe2+熄灭 D* + Fe2+ D + Fe3+ 有荧光 无荧光 发生电子转移反应的熄灭剂并不限于金 属离子， I， Br， S2O32等易于给出电子的 阴离子对奎宁、罗丹明及荧光素钠等有机荧 光物质也会发生熄灭作用。 （ e） 荧光物质的自熄灭 荧光物质溶液的浓度大于 1g/L时，常常 发生自熄灭现象，所以液态纯物质的荧光一 般都不强烈。 此种熄灭的原因： ）由于浓度大，分 子碰撞几率大，因而引起能量损失大； ） 溶液浓度过高，物质分子发生二聚体乃至多 聚体，这些多聚体不发光。 综上所述： 无论何种类型的熄灭作用，均随熄灭剂 浓度的增加而增大。 如对试液进行稀释则可消除或降低荧光 的熄灭作用。 这里 O2的熄灭作用并未消除，需在试液 中通 N2或 CO2以驱逐 O2，方可达到消除的目 的。 （ 6） 光散射 光散射常常关系到一个实验的灵敏度和 再现性。 实践中常遇到的光散射包括溶液的瑞利 散射和拉曼散射、器壁的散射及胶粒的散射 （丁铎尔散射）。 当物质分子吸收了频率较低的光能后， 并不足使分子中的电子跃迁到电子的激发态， 而只是上升到基态中较高的振动能级上去， 若在 1015~1012s返回到原能级，此时辐射出 和激发光相同波长的光，称为 瑞利散射。 若返回到较原能级稍高或稍低的振动能 级上，辐射出较激发光稍长或稍短的光，称 为 拉曼散射。 （ 7） 表 面吸附 在稀溶液中 （ 1g/mL）， 表面吸附尤 为明显，特别是有机溶剂，此吸附更为厉害。 溶质常常吸附在瓶子、吸管和吸收池等壁上。 芳香族化合物易吸附，并且所用溶剂的 极性越小，吸附就越大。 在非极性溶剂中加一点极性溶剂，常常 可以减少这种吸附损失。  荧光分析的仪器、特点及注意事项 １ . 荧光的分析仪器 由光源发出的光，经第一单色器（激发 单色器）后，得到所需要的激发光波长。 荧光物质被激发后，将向四面八方发射 荧光，但为了消除入射光及散射光的影响， 荧光的测定应在与激发光呈直角的方向上进 行。 仪器中的第二单色器称为荧光单色器。 它的作用是消除溶液中可能共存的其它光线 的干扰，以获得所需要的荧光。 （ 1） 光源 光源应具有强度大、适用波长范围宽两 个特点。 常用光源有高压汞灯和氙弧灯。  高压汞灯常用在荧光计中，发射强度大而 稳定，但不是连续光谱。 高压汞灯的平均寿 命均为 1500~3000 h，荧光分析中常用的是 365 nm、 405 nm、 436 nm三条谱线。  氙弧灯（氙灯）是连续光源，发射光束强 度大，可用于 200~700 nm波长范围。 在 200~ 400 nm波段内，光谱强度几乎相等。 但氙灯需要稳压电源以保证光源的稳定。 此外，高功率连续可调染料激光光源是 一种新型荧光激发光源。 激光光源的单色性 好、强度大。 脉冲激光的光照射时间短，并 可避免感光物质的分解。 （ 2） 激发光单色器 在荧光计中，通常采用激发滤光片和荧 光滤光片作为激发光束和荧光辐射的波长选 择器。 而大部分的荧光光度计中至少选用一 个，而常常是用两个光栅单色器，且均带有 可调狭缝，以供选择合适的通带。 作用： 提供单波长的激发光。 色散元件：棱镜或光栅。 出射狭缝宽度可调。 激发滤光片、激发单色器的作用是让所 选择的激发光透过并照射于被测试样上。 荧光滤光片、发射单色器的作用是把激 发光所发生的容器表面的散射光、瑞利散射 光和拉曼光以及溶液中杂质荧光滤去，让荧 光物质发出的荧光通过而照射到检测器上。 分光荧光计的入射狭缝及出射狭缝是用以 控制通过波长的谱带宽度及照射到测定试样上 的光能强度的。 测定的目的不同，可以选择不同的狭缝， 以获得较好的测定结果。 （ 3） 试样池 荧光分析用的试样池需用低荧光材料制成。 常用石英为材料， 形状为四面透光的方形。 试样池的形状以散射光较小的方形为宜。 有的荧光计附有恒温装置。