吴梧桐主编生物制药工艺学学习笔记

吴梧桐主编生物制药工艺学学习笔记内容摘要：

的洗脱峰宽度成反比。 第 8 章 离子交换 离子交换常用洗脱方法： 从树脂上洗脱目的物的方法主要有两种： （ 1） 调节洗脱液的 pH，使目的物粒子在此 pH 下失去电荷，甚至带相反电荷，从 而丧失与原离子交换树脂的结合力而被洗脱下来。 （ 2） 用高浓度的同性离子根据质量作用定律将目的物离子取代下来。 离子交换树脂的命名法。 举两种树脂骨架。 树脂命名编号：强酸类 1~100号，弱酸类 101~200号，强碱类 201~300号，弱碱类 301~400号，中强酸 401~500。 各种树脂除注明类别和编号外，还需标明载体的交联度。 书写交联度时，将百分号除去，写在树脂编号后并用乘号“ X”隔开。 强酸 1X7，交联度为 7%。 树脂骨架：（ 1）苯乙烯型离子交换树脂 （ 2）丙烯酸型阳离子交换树脂 （ 3）多乙烯多胺 —— 环氧氯 丙烷树脂 （ 4）聚乙烯砒啶系离子交换树脂 （ 5）其他离子交换树脂 蛇笼树脂 选择性离子交换树脂 热再生离子交换树脂 离子交换的选择性的因素：一、离子化合价与水合半径的影响 二、离子化合价与离子浓度的影响 三 |、交换环境的影响 （ 1）溶液的 pH （ 2）离子强度 （ 3）有机溶剂 四、树脂结构的影响 （ 1）树脂载体交联度 （ 2）辅助力 （ 3）其他结合力 五、偶极离子排斥作用。 偶极离子的交换特点：净电荷为零时，正电中心和负电中心并不重叠，遂成偶极。 钠型树脂，被吸附的氨基酸的羧基所带的负电荷与树脂 磺酸基的负电荷产生排斥力。 偶极离子的排斥作用，所以使树脂对氨基酸的吸附量大大降低。 氢型树脂：由于氨基酸的解离度低，被取代之氢离子为羧基所固定，使被吸附的氨基酸不能形成偶极，故与树脂磺酸基没有排斥力。 偶极离子的排斥力随氨基酸的 R基碳链的加长而减弱。 适当增加溶液中离子强度，偶极排斥力减弱。 大孔、均孔树脂的特点：大孔型离子交换树脂的特征： 1 载体骨架交联度高，有较好的化学和物理稳定性及机械强度。 2孔径大，不受环境条件的影响，动力学性能好，抗污染能力强，交换速度快。 3 表面积大，表面吸附能力强，对大分子物质的 交换容量大 4 孔隙率大，比重大，对小离子的体积交换量比凝胶型树脂小。 均孔树脂的特点：主要为阴离子交换树脂，骨架的交联度比较均匀，孔径大小一致，重量和体积交换容量都较高，膨胀度、相对密度适中、机械强度好、抗污染和再生能力强。 离子交换纤维素的特点及洗脱。 离子交换纤维素为开放的长链骨架，大分子物质能自由地在其中扩散和交换，亲水性强，表面积大，易吸附大分子；交换基团稀疏，对分子的实际交换容量大；吸附力弱，交换和洗脱条件缓和，不易引起变性；分辨率强，能分离复杂的生物大分子混合物。 洗脱：对离子交换纤维素进行吸附 后的洗脱一般比从离子交换树脂的洗脱缓和。 升高环境的 pH 或是降低环境的 pH或增加离子强度都能将被吸附物质洗脱下来。 酸碱性蛋白选择合适的离子交换纤维素。 酸性蛋白质（等电点约 pH5），作为一个阴离子，它的 DEAE纤维素柱层析可在 pH5。 5~9。 0之间进行，蛋白质和交换剂都是解离的，带有相反的电荷。 在 CM纤维素上层析则需限制在（ ~）之间。 碱性蛋白质（等电点约 pH8）作为一个阳离子，用羧甲基纤维素层析可在 pH3.~ 进行。 离子交换聚焦色谱的原理： （ 1） pH 梯度的形成：色谱聚焦 利用离子交换剂本身的带电基团的缓冲作用，当洗脱缓冲液不断滴到离子交换柱上时，柱内自动形成 pH 梯度。 （ 2）蛋白质的色谱行为：蛋白质所带电荷取决与他们的等电点和介质的 pH 低于它的等电点时，蛋白质带正电荷，它不与阴离子交换剂结合，随洗脱液向下移动。 （ 3）聚焦效应：当一种蛋白质在柱上随洗脱液下移至等电点处，移动速度明显减慢。 加上相同的第二个样品，它将以洗脱液移动的速度下降，直到追到正在慢移的第一个样品成分处（聚焦）。 然后这两个样品一起下移，往柱下一起洗脱出来。 所有的样品必须在第一个样品峰尚未 被洗脱前加入。 9举例三种常用离子交换树脂和离子交换纤维素。 大孔型强酸型离子交换树脂 大孔型弱酸型离子交换树脂 大孔型弱碱型离子交换树脂 甲基磺酸纤维素 乙基磺酸纤维素 二乙基氨基乙基纤维素 苄基化的 DEAE 纤维素 术语： CMC：羧甲基纤维素。 DEAEC：二乙氨基乙基纤维素。 PBE94：多缓冲交换剂 尼柯尔斯方程： m1(1/z1) / m2(1/z2) = K c11/z1 / c21/z2..交换容量： meq/g(毫克当量 /克树脂 ) 树脂再生：使用过的树脂重新获得使用性能的处理 过程。 偶极离子排斥：被吸附的氨基酸的羧基所带的负电荷与树脂之负电荷产生排斥力。 蛇笼树脂：由丙烯酸或甲基丙烯酸在季胺型阴离子交换树脂中聚合而成的一类树脂。 第九章 亲和层析 亲和层析原理，主要特点。 利用生物体中多数大分子物质具有与某些相应的分子专一型可逆结合的特性。 主要特点：经过一此简单的处理就可以获得所需的高纯度活性物质。 对设备要求不高，操作简便，使用范围广，特异性强，分离速度快，分离效果好，分离条件温和。 缺点是吸附剂的通用性较差。 选择配基的注意点：（ 1）配基与配体由足够大的亲和力（ 2） 配基与配体的结合应是专一的（ 3）配基应具有化学活性。 手臂，其长短与亲和层析的效果的联系，为什么。 由于酶的活性中心常是埋藏在其结构的内部，它们与介质的空间障碍影响其与亲和配基的结合作用。 在载体和配基之间插入手臂，以消除空间障碍，手臂的长度是有限的，太短不能起消除空间障碍的作用，太长会使非特异性性吸附增加。 制作高亲和力的亲和吸附剂 :提高亲和层析效果，固定相的配基和流动相的配基具有较强的亲和力。 配基浓度对亲和力的影响。 为了将亲和配体和其他物质分开，在实际亲和层析时，通常需要阻流值≥ 10。 空间障碍的影响：插入适当长度的手臂。 配基与载体的结合位点的影响。 载体孔径的大小对吸附剂的亲和能力有决定性的作用。 微环境的影响，包括载体及手臂的电性、极性、次级键对配基亲和力的影响。 非专一性吸附包括那些：如何克服。 亲和层析中的非专一性吸附有以下情况：（ 1）离子情况 （ 2）疏水基团 a长的烃类结构的“手臂” b疏水性配基 （ 3）复合亲和力 确定离子 强度以获得良好的分离效果 亲和层析洗脱方法：（ 1）非专一性洗脱 改变洗脱剂的 pH 以影响电性基团的解离程度而洗脱（ 2）特殊洗脱 （ 3）专一性洗脱 竞争性效应 非竞争性效应 反竞争性效应 二次作用亲和沉淀 :利用在物理场（如 pH、离子强度、温度和舔加金属离子等）改变时溶解度下降，发生可逆性沉淀的水溶性聚合物为载体固定亲和配基，制备亲和沉淀介质。 亲和介质结合目的分子后，通过改变物理场使介质与目标分子共同沉淀的方法。 亲和膜分离原理及特点：亲和膜利用亲和配基修饰的微滤膜为亲和吸附介质亲和纯化目标蛋白质，是 固定床亲和层析的变型。 优点：（ 1）传质阻力小，达到吸附平衡的时间短，配基利用率高。 （ 20压降小，流速快，设备体积小，配基用量低。 缺点：理论塔板很低，吸附和清洗率低。 9 术语： 亲和力：配基对互补分子间的作用力，是制备高效亲和柱的重要参数。 亲和吸附剂：载体 —— 配基。 配基：在亲和层析中起可逆结合的特异性物质。 阻流值： Ve/Vo。 正洗脱：吸附提取物中的有效成分。 负洗脱：去处提取物中的杂质。 金属螯合层析：利用金属离子的络合或形成螯合物的能力吸附蛋白质的分离系统。 有机染料亲和层析：有机染料如蒽醌化合物和偶氮 化合物具有类似于 NAD+的结构，一些需要核酸类物质为辅酶的酶，对这些染料具有一定的亲和力，将这些染料共价偶联到纤维素或琼脂等多糖载体上，就制得亲和层析柱。 亲和错流过滤： (affinity cross flow filtration)ACFF 将亲和层析与超滤技术结合，高分子底物经专一可逆的亲和反应后，用膜进行错流过滤，兼有亲和层析与膜过滤的优点。 亲和萃取：利用偶联亲和配基的 PEG 为成相聚合物进行目标产物的双水相萃取，可在亲和配基的亲和作用下促进目标产物在 PGE相（上相）的分配，提高目标产物的分配系数和选择 性。 亲和反胶团萃取：是指在反胶团相中除通常的表面活性剂（如 AOT）外，舔加另一种亲水头部为目标分子的亲和配基的助表面活性剂，通过亲和配基与目标分子的亲和结合作用，促进目标产物在反胶团相的分配，提高目标产物的分配系数和反胶团萃取分离的选择性。 第十章 离心技术 相对离心力：（ RCF）离心力与重力的比值。 用符号“ g” 或 “ g” 表示。 RCF= 106 N2 r ( g) 离心机转子有几种，各自特点。 （ 1）角度转子：机械强度高，重心低，运转平稳，寿命长，管内温度分布均匀，温差对流小，离心时间短，使用方便，但离心管外壁易产生强烈对流和涡流，同时管外侧会出现沉淀，形成壁效应。 （ 2）水平转子：结构复杂，加工困难，机械强度低，重心高，容量小，低速运转时易摇摆，离心时间长，寿命短而价格高。 对流作用小，“壁效应”弱。 （ 3）区带转子： Anderson 转子，无离心管，“十”字隔板将样品槽分为四个扇形室。 无壁效应，适用于大量样品的密度梯度及等密度梯度离心。 配有附属设备和仪器，操作过程复杂，设备较贵，但离心机使用效率 高。 （ 4）垂直管转子：特殊类型的定角转子。 离心时的碰撞及温差引起的对流不显著。 颗粒沉降时间短，可用于差速、密度梯度及等密度离心，用于平衡等密度离心时效果最佳。 （ 5）连续离子转子：低速或高速离心机转子，可用于超速离心机。 结构简单，低速时加样，高速时排出清夜。 用于实验室，也可用于小规模生产，最适宜自培养液中收集菌体及细胞。 （ 6）细胞洗脱转子：低速离心时连续分离型转子，最高转速不超过 6000r/min。 最适于自动植物培养液或发酵液中连续分离单细胞和菌体，回收浓度及回收率均较高。 速度区带离心的特点及其用 途：离心操作时将样品液置于连续或不连续线形或非线形密度梯度液上，控制离心时间，使所需组分通过部分梯度液，形成的分离区带在达到其等密度区之前即停止离心。 速度区带离心的特点：（ 1）样品加于梯度介质的顶步、离心时间需严格控制。 （ 2）介质的密度需严格掌握：梯度最大值≤组分最小密度（ 3）样品的密度 梯度密度最小值 (4)分离依据是各组分之沉降系数差（ 5）分辨率受组分沉降系数、离心时间、颗粒扩散系数、介质黏度及梯度范围和形状的影响。 本法适于分离颗粒大小不同而密度相近的组分，如 DNA 与 RNA 混合物、核蛋白体亚单位及线 粒体、溶酶体及过氧化酶体。 差分离心的特点、用途。 原理是依据不同大小和密度的颗粒在离心力场中沉降速度的差异进行离心分离。 所得的沉淀物只具有相对纯度而不具有绝对均一性。 密度梯度的设计包括：（ 1）密度梯度介质的选用（ 2）梯度的密度范围（ 3）梯度的形状 （ 4）梯度的容量、（ 5）直线型梯度的斜率 “密度梯度”通常的制备方法：（ 1）不连续梯度的制备、（ 2）混合梯度法（ 3）离心平衡法 梯度的取出与收集的方法：（ 1）底部穿刺法（ 2）顶步收集法 取代法 虹吸法 （ 3）切割法 冻结切割法 聚合切割法 8术语 区带转子： Anderson 转子，无离心管，“十”字隔板将样品槽分为四个扇形室。 无壁效应，适用于大量样品的密度梯度及等密度梯度离心。 角度转子：定角转子 速度区带离子法：离心操作时将样品液置于连续或不连续线形或非线形密度梯度液上，控制离心时间，使所需组分通过部分梯度液，形成的分离区带在达到其等密度区之前即停止离心。 差分离心：差速离心。 原理是依据不同大小和密度的颗粒在离心力场中沉降速度的差异进行离心分离。 所得的沉淀物只具有相对纯度而不具有绝对均一性。 等密度离心法：离心平衡法，在离心力的作用下，不同 密度的多组分颗粒在梯度介质中“向上”或“向下”移动。 当移动至其密度与介质密度相等的位置便不再移动，形成静止区带，即达到离心平衡。 第十一章 过滤和膜分离技术 用于制作透析膜的材料所应具有的特点： （ 1） 在使用的溶剂介质中能形成具有一定孔径的分子筛样薄膜。 由于介质一般为水，所以膜材料应具有亲水性，它只允许小分子溶质通过。 （ 2） 在化学上呈惰性。 不具有与溶质、溶剂起作用的基团。 （ 3） 有良好的物理性能。 包括一定的强度和柔韧度，不易破裂，有良好的再生性能，便于多次重复使用。 透析装置的类型：（ 1）旋转透析器 （ 2）平面透析器 （ 3）连续透析器 （ 4）浅流透析器 克服浓差极化现象的措施： 克服极化的主要措施有振动、搅拌、错流、切流等技术，但应注意过于激烈的措施易使蛋白质等生物大分子变性失活。 此外，将某种水解酶类固定于膜上，能降解造成极化现象的大分子，提高流速。 不过这种措施没有通用性，只适用于一些特殊情况。 实验用超滤器的类型： （ 1） 无搅拌式装。