双孢蘑菇制种技术

双孢蘑菇制种技术内容摘要：

市售的新洁尔灭是季胺盐类的表面活性剂。 化学名称为十二烷基溴化胺，淡黄色，有香味的胶状体。 一般可将原液 (5%)稀释一倍，把器械或手、以及不能遇热 的器具进行消毒。 对细菌、病毒有较好的杀灭能力，但对真菌杀灭效果不好。 经常使用新洁尔灭会使皮肤干裂，同时对粘膜有刺激性，对铝制品有腐蚀性，对橡胶没有消毒作用。 因此，不能用新洁尔灭消毒胶塞进行担子菌菌种保藏。 表面活性剂的杀菌机理是改变细胞透性，使菌全破裂；聚集在菌体表面时，影响细胞代谢，破坏细胞蛋白与酶的活性。 ９、气雾消毒盒 三、消毒与灭菌效果的检查 消毒与灭菌效果好坏，直接关系到菌种成品率的高低。 因此，除了要严格把好消毒、灭菌关外，同时还要严格执行检验制度，两者缺一不可。 （一）培养基灭菌效果检验 １、 试管母种培养基经灭菌后，从高压灭菌锅中不同部位随机抽取５支，放置 28177。 2 ℃ 恒温箱中培养57 天 ,如无霉菌、细菌、酵母等杂菌出现，则认为灭菌彻底。 ２、原种及栽培种培养基经灭菌后，从灭菌锅中上、中、下三层进行取样，每层对角线随机取样５瓶（袋），放置 2830℃ 恒温培养箱中培养 57 天，检查是否有霉菌菌落生成。 如检查是否有细菌没有杀死，必须使用细菌培养基进行检测。 细菌培养基：称取牛肉浸膏 (或牛肉汁 )10 克 ,蛋白胨 10 克 ,NaCl15克 ,琼脂粉 14 克 , 加蒸馏水 1000ml,经加热溶解后 ,装入试管中 ,在 121℃ 条件下灭菌 15分钟 ,随后排成斜面试管。 上述抽取的样品，分别在无菌下取出少量培养基接入细菌培养基，然后在 37℃ 培养 24小时，检查结果没有细菌菌落产生，说明灭菌彻底。 如某一位置试样出现杂菌，可能是锅内有 “ 死角 ” ，也可能是灭菌锅结构不合理，或没有按操作要求堆积， 气撒料，或一次性撒料过厚，或菌种瓶、袋过于拥挤，蒸汽流通不均匀造成；如不分部位，大部分或几乎全部瓶、袋都出现杂菌，说明灭菌温度或灭菌时间不够，如果是高压灭菌锅出现这种现象，则说明是冷窑没有排除干净所致。 （二）接种室（无菌室）、箱灭菌效果检验方法 １、平 皿法 先制作常任的霉菌培养基，如 CPDA、 PDA、 BSA 等，灭菌后，常规制作无菌平皿培养基（简称平板）。 检查接种室（箱）灭菌合格与否，随机取几组无菌平皿培养基（每组 35 个平皿）在接种室（箱）台面上不同位置打开置放的平皿， 其中一组不打开平皿盖作为对照，开盖平皿放置５分钟，然后盖上盖，与对照组同时在 30℃ 培养 72 小时 ,检查在平皿培养基上是否有霉菌菌落。 实验组少于１个菌落，视为灭菌合格。 检查细菌方法同上，一般采用 MPSA 培养基。 不同的是将实验的平皿均放置在 37℃ 下培养 24 小时 ,至多不超过 48 小时。 ２、试管 法 将上述常规真菌与细菌培养基斜面各取 35 支为一组 ,放置接种室 (箱 )内 ,按无菌操作将其中实验组棉塞打开 ,经 30 分钟后 ,再将无菌棉塞塞好 ,与对照组同时放在 30℃ 和 37℃ 进行 (细菌与霉菌 )培养。 细菌在培养 2428 小时后观察， 霉菌在培养 72 小时后观察 ,实验组均不长任何菌落 ,视接种室、箱灭菌良好。 菌种分离即是进行蘑菇菌丝的纯化过程，它是制种工作的重要环节，通俗讲是把蘑菇菌丝从自然界中单独分离出来进行纯培养，从而获得纯蘑菇菌丝生长的菌种。 蘑菇菌种的分离方法有三种：即孢子分离、组织分离和基质菌丝分离法。 一、孢子分离法 蘑菇孢子分离法，是利用成熟子实体的有性担孢子能自动从子实体层中弹射出来的特征，在无菌条件下和适宜的培养基上，使孢子萌发成菌丝，获得纯种的一种方法。 孢子分离可分为单孢分离和多孢分离法两种，由于是从有性担孢子（是指其细胞核已经地核配过程）分离纯菌丝体，因此生产上多采用多孢分离法来保持菌株的原有特性，而单孢分离法主要应用于菌株的筛选和杂交育种等工作，孢子分离主要分为两个步骤，首先是采集孢子，其次进行单孢或多孢子分离。 （一）采集孢子 １、种菇的选择 采集孢子首先要选好种菇即分离用的子实体。 一般 蘑菇种菇要求是第一潮菇，出菇较早，单生，个体健壮，特征典型的子实体，经过仔细的观察筛选后在菇床上做个记号，让种菇充分生长，直至即将破膜时将菇采摘进行孢子弹射。 ２、孢子弹射收集 种菇采收后可浸入 %升汞溶液中消毒约一分钟，用镊子取出后经无菌水冲洗数次，再用无菌滤纸把表面水吸干，或直接用 75% 酒精棉球轻轻控拭菌盖及菌柄进行表面消毒。 随后用无菌刀切掉多余菌柄（约留下 即可），把菇直立，菇柄朝下插入铝线制作的支持物上，放入了先准备好铺有无菌滤纸条的平皿上，盖上钟罩（如图 所示）。 这套孢子收集装置 需事先进行高压灭菌消毒。 把装好子实体的孢子弹射收集器放在温度为 1520℃ 的室内 ,经 2448 小时左右， 可见到无菌滤纸上有褐色的蘑菇孢子印。 在无菌操作下把收集到蘑菇孢子的滤纸条装入无菌的空试管中，并在温度下进行真空干燥，之后放入冰箱可长期保存备用。 （二）孢子分离 １、多孢分离法 即把多个孢接种在同一培养基上，让它们萌发共同生长交错在一起，从而获得纯种的一种方法，由于多个孢子间的种性互补，基本上可以保持亲本的稳定性，此法比较简易，在过去的蘑菇制种中应用较为普遍。 （１）斜面划线法：按无菌操作规程，用无菌接种环从收到孢子的滤纸条上沾取少量孢子，在 PDA 试管斜面培养基上自下而上划线，划线时勿用力， 以免划破培养基表面，接种完毕，抽出接种种灼烧试管口，塞上棉塞，放置 24℃ 恒温培养箱中培养，待孢子萌发后（一般约 1520 天），挑选萌发快，长势旺的菌落， 转接于新试管培养基上再行培养。 （２）涂布分离法：按无菌操作方法，取一小块具有孢子的滤纸条，放入装有无菌水的小三角瓶中，充分摇匀制成孢子悬浮液，然后用已灭菌的试管，吸取孢子悬浮液，滴 12 滴到 PDA 试管或培养皿培养基上，转动 试管使孢子悬浮液均匀分布于斜面上，或用玻璃涂布棒将平板上的悬浮液涂布均匀。 孢子在培养基上经 24℃ 恒温培养萌发后，挑选几株发育匀称，生长速度快的菌落，移接于另一试管斜面培养基上，恒温培养即为母种。 ２、单孢分离 就是将采集到的孢子群单个分开进行培养，让它单独萌发成菌丝而获得纯种的方法，单孢子分离的方法，按分离的手段可分为以下三种。 （１）稀释分离法：这是通过不断稀释孢子悬浮液，使孢子分散最终孢子浓度控制在 300500 个孢子 /毫升 ,吸取 毫升的孢子液注入平板均匀涂布，分散孢子各自萌发形成单孢菌落，其步骤如 下： ① 制备无菌水试管 :取 10 支试管 ,其中 1 支装 100 毫升蒸馏水 ,其它 9 支装 9 毫升蒸馏水 ,经高压灭菌即成无菌水。 ② 制孢子悬液：取一小块收集有孢子的滤纸条，浸入 10 毫升无菌水试管中 , 摇振使孢子分散成悬液 ,用无菌 1 毫升移液管吸取 1 毫升孢子悬液于第 2 支试管中 , 摇振使其分期 ,再从第 2 支试管中吸取 1 毫升注入第 3 支试管中 , 如此反复稀释直到孢子浓度达到 300500 个孢子 /毫升 ,备用。 ③ 制培养基平板：配制 PDA 培养基 ,装入三角瓶中进行高压灭菌 , 准备倒平板的培养皿也经过高压灭菌备用 ,待已灭菌的 PDA 冷却至 5060℃ 时 ,在无菌操作下倒 1520 毫升 PDA 至培养皿中 ,培养皿放平 ,昼使培养基表面光滑 ,厚度一致。 ④ 孢子涂布：在无菌操作下，吸取 毫升的孢子悬浮液滴在平板培养基表面上 ,使用 T 氏棒把孢子均匀涂布在平板上 ,盖上刺激菌丝培养皿 ,放置于 2425℃ 恒温箱中培养。 ⑤ 挑选单孢子萌发菌落：一般孢子经过５天的培养开始萌发长出菌丝，培养皿经过显微镜的镜检确定孢子萌发的菌落是由单个孢子萌发成长而成的，可使用打孔器进行打孔把该菌落移接至新鲜的 PDA 斜面试管中继续培养。 打孔器的外径应小于显微镜的视野范围，而且打孔之前须 检查该菌落周围是否有孢子或其它菌落，昼使打孔不会触及周边的孢子或菌落，确保纯种。 （２）毛细管法：孢子悬浮液经过稀释，使用毛细滴管把孢子悬浮液滴一小滴于皿盖内，昼使每一滴只含有一个孢子，从而达到单孢子分离，其方法如下： ① 孢子悬浮液制备同稀释分离法，孢子浓度控制在 200300 个孢子 /毫升。 ② 毛细滴管制备 :取洁净的玻璃管在酒精喷灯上先拉成外径 1 毫米的细管 , 稍冷却后再加热并迅速拉长 ,使管尖内径约 200 微米 ,剪断即成毛细滴管 ,在滴管后端塞棉花 , 装入消毒盒中后进行灭菌备用。 ③ 点样镜检：用毛细滴管吸取经稀释 的孢子悬浮液约 毫升 (可滴 30 滴 ),在无菌操作下 ,快速点于皿盖内壁的标记圈中央 ,滴液应小于低倍镜的视野 , 点样后的培养皿仍盖在有水琼脂的皿底上 ,贴胶布固定后再用低倍锐检查皿盖内壁的的液滴 ,确定是单孢者 ,即在皿盖上标上记号。 ④ 培养基推贴及刺激培养：使用接种针取一小块 PDA 培养基 (约 22 毫米方块 ) 推贴至标记为单孢子的液滴 ,使液滴中的孢子能够吸附到培养基边缘。 将事先培养好蘑菇气生菌丝的平板培养皿盖取下，套在菌丝平板的底部，再把已分离并推贴好的培养基的皿盖罩在套有菌丝平板的玻璃皿上，使两个皿盖对接，贴胶 布封口 (要留 厘米缝用作通气 ),这样就形成一个刺激单孢子萌发的培养室 ,置培养箱中 24 ℃ 下培养 ,待单孢子萌发 ,及时撕下胶布 ,用接种铲挑取已萌发的单孢菌丝贴块 ,移接到新鲜 PDA斜面试管中 ,置 24℃ 恒温箱中培养 ,即可区得单孢纯种。 （３）器械分离法：应用显微操作器，直接挑选单孢子，移至 PDA 平板中进行孢子刺激萌发培养 ,获得单孢纯种。 ① 孢子悬浮液制备：同稀释分离法，孢子浓度控制在 1000 个 /毫升。 ② 平板涂布 :将稀释后的孢子悬浮液滴 ,用无菌的 T氏棒进行均匀涂布 ,每个平板含孢子大约 100 个 左右。 ③ 镜检分离 :待涂布均匀的平板琼脂表面水分干燥后即可于显微镜下观察 ,当在视野中心见到孢子 ,而视野周围无其它孢子时 ,可用显微操作器操纵玻璃针把孢子从培养基表面挑取 ,随后把孢子转移至 PDA平板的表面上 ,进行孢子萌发培养 ,孢子萌发培养须使用蘑菇气生菌丝刺激培养 ,才能提高萌发率 ,培养的具体操作方法与涂布分离法相同。 （４）单孢子菌落接待：当孢子经过 10 天的刺激培养 , 肉眼可见到菌丝生长而成小菌落 ,应及时用打孢子器把该菌落分离 ,每天都应观察孢子萌发情况 , 如果不及时把菌落移接 ,该菌落会快速生长而影响较迟萌发单孢 子的分离。 二、组织分离法 组织分离法是利用子实体组织来分离获得纯菌丝的方法。 组织分离系一种无性繁殖法，双亲的染色体没有经过重组，因此组织分离基本上可保持亲本的生物不特性，棒操作简便，取村广泛，在过去传统的稳定菌株中常采用此方法进行菌种的分离，退化不明显，但是随着蘑菇杂交菌种的应用，由于杂种本身所具有的不稳定，组织分离常造成菌株的退化，目前生产上很少采用，只是进行野生菌株分离时，才比较常用。 其方法如下： ① 挑选种菇：其标准与孢子收集要求相同； ② 菇体消毒：将子实体菌柄基部切除 ,置接种箱内 ,用 75%酒精对菇 体表面进行消毒。 ③ 组织分离 :解剖刀。