发酵技术实验指导书

发酵技术实验指导书内容摘要：

忌液体流动。 25℃培养 2－ 3 天即有菌落出现。 用接种挑取分生孢子接于察氏培养基斜面， 25℃培养 2－ 3 天。 性能测定 将各分离株接种于酸性蔗糖培养基中（ 500mL 三角瓶中装有培养基 25mL）， 30℃振荡培养 24－ 48 小时。 柠檬酸鉴定 取 5mL 发酵液于洁净试管中，加 Deniges 氏液 1mL，加热至沸，然后一滴一滴地加入高锰酸钾溶液，若有白色沉淀，即证明有柠檬酸存在。 生酸量的测定 以常规酸碱中和的方法测定，柠檬酸的毫克当量为 ，以此计算出柠檬酸的百分含量。 五、实验结果 描述产柠檬酸黑曲霉的菌学特征。 记录性能测定的结果。 六、思考题 黑曲霉的工业用途主要有哪些。 实验六 啤酒酵母发酵力的测定 一、实验目的和要求 了解酵母发酵力的测定的原理及应用； 学习酵母发酵力的测定操作技术。 二、实 验原理 酵母菌的发酵力反映酵母对各种糖类的发酵情况，一般包括二氧化碳失重的测定、发酵度的测定和酒精度测定。 正常的啤酒酵母能发酵葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖和麦芽三糖等。 但酵母的酶系不同，发酵糖的能力也不同，发酵过程中除产生乙醇外，还伴有二氧化碳形成，形成的二氧化碳从发酵液中挥发出，使整个体系的重量减轻，根据减轻的程度，可测定发酵速率的快慢；发酵度测定是基于酵母降糖的能力，即发酵前后发酵液中糖分减少的幅度；对酒类工业，酵母菌的产酒能力要求较高，一般的酒度测定常采用蒸馏法。 三、实验材料 菌种 酿 酒酵母。 培养基 麦芽汁。 （见实验四或附录） 试剂和器具 发酵瓶、发酵栓、比重瓶、恒温水浴、烧瓶、冷凝器。 四、实验方法 取无菌的 500mL 三角瓶，内装 12oBrix 的麦芽汁或 1822oBrix 果汁 250mL，加棉塞灭菌，冷却后接种培养 24 小时的酵母种子液 ，然后将棉塞换成发酵栓，于 2025℃培养 110 天。 二氧化碳失重的测定 接种完毕后，称重发酵瓶，在发酵过程中每 8 小时称量一次，称前应先摇晃瓶子，以赶除二氧化碳，随着发酵时间的延续，瓶重逐渐减轻，直到减 轻量不高于 ，即表示发酵完毕。 然后以产生二氧化碳的量为纵坐标，发酵时间为横坐标，绘制发酵速率曲线。 发酵度的测定 （ 1）原麦汁浓度的测定（用附温比重瓶法）将附温比重瓶用洗液浸泡，取出后彻底洗涤为中性，再用乙醇、乙醚顺序洗涤数次，吹干后准确称量（用分析天平），此数据为 W1，即比重瓶的重量。 然后用煮沸 30 分钟，冷却至 15℃的蒸馏水注满比重瓶，装上温度计（瓶中应无气泡），立即浸入 20177。 ℃恒温水浴中，到比重瓶上的温度计达到 20℃，并保持 2030 分钟不变后取出，用滤纸吸去测管的水，立即盖上罩放置 ，直到比重瓶升到室温后擦干，称其重量，此数值为 W3，即比重瓶和水的重量。 倾出比重瓶中的水，先用约 10mL 过滤麦芽汁（已灭菌）洗涤 23 次后，注满麦汁，按上法测定其重量，此数值为 W2，即为样品和比重瓶的重量。 那么样品（即过滤麦汁）的比重 D2020 可以由下式表示： D2020 =（ W2－W1） /（ W3－ W1），即 20℃样品与同体积 20℃水的重量之比值。 然后从《啤酒工业手册》中可查出 20℃样品比重对应得样品浓度，即原麦汁浓度（用 P 表示原麦汁浓度）。 附温度计的比重瓶：如上图所示。 左为 精密比重瓶，右为普通比重瓶 l比重瓶； 2支管标线； 3支管上小帽； 4附温度计的瓶盖 （ 2）外观浓度的测定（用 m表示） 用比重瓶法测得发酵液或成品酒 20℃时的比重，从《啤酒工业手册》查出浸出物含量，即为外观浓度。 （ 3）真正浓度的测定（用 n表示） 取一蒸馏烧瓶，向其中加入 100g 除去气体并经过过滤的发酵液， 80℃左右蒸出其中的酒精，待蒸出三分之二时， 自然冷却，称量。 加蒸馏水补足 100g，再置于 15℃水中摇匀，然后用附温比重瓶法测得此液体的比重，查《啤酒工业手册》得此液体中浸出物的含量，即为外观浓度。 发酵度的计算可由下式求得： 外观发酵度 = 原麦汁浓度 观浓度原麦汁浓度－发酵液外 179。 100%= PmP－ 179。 100% 真正发酵度 = 原麦汁浓度 馏后的真浓度原麦汁浓度－发酵液蒸 179。 100%= PnP－ 179。 100% 酒精度的测定 用 100mL 的容量瓶（烘至恒重）称取 100g 除去气体的发酵液 或成品啤酒。 转入 500mL 烧瓶中，用 50mL 蒸馏水分数次洗涤容量瓶，并转入烧瓶中，连接好冷凝器，加热缓慢蒸馏。 再将一个已知重量的 100mL 容量瓶浸入冰水中，接收蒸出的蒸馏液。 当流出液体积为 90mL 左右时，停止蒸馏，将蒸馏液重量调至 100g，混合均匀，用附温比重瓶法测定蒸馏液 20℃时的比重，然后从《啤酒工业手册》中查出酒精的重量百分比。 根据测得的酒精重量百分比还可计算发酵率。 因为每 100g 的葡萄糖可产纯酒精的数量为 ，则发酵率可由下式求得： 发酵率 =理论生成的酒精数实际生成的酒精数179。 100% 五、实验结果 以产生二氧化碳的量为纵坐标，发酵时间为横坐标，绘制发酵速率曲线。 记录发酵度测定的结果，计算发酵度。 记录酒精度测定的结果，计算发酵率。 六、思考题 发酵力测定的意义主要有哪些。 一般包括哪些测定内容。 实验七 酵母菌热死温度的测定 一、实验目的和要求 了解酵母菌热死温度测定的原理及意义； 学习酵母菌热死温度测定的操作技术。 二、实验原理 热死温度是指液态培养的微生物，在某温度下 10 分钟即被杀死，此温度称为微生物的热死温度。 啤酒酵母一般在 45℃时就停止生 命活动，热死温度一般在 5054℃，测定酵母菌的热死温度是掌握酵母性质必须具备的知识之一。 酵母的热死温度往往受培养基的含水量，微生物细胞的含水量，培养基的pH 值，培养基中氮的含量、细胞的菌龄和是否形成孢子等影响，为了防止这种缺点，习惯上先将试验酵母移到液体培养基中，在 25℃培养 24 小时，或者从扩大培养的酵母中采取。 酵母的热死温度除与培养基种类有关外，与加热时间长短也有关。 在啤酒厂所选择的温度为 4060℃。 每个间隔温度为 2℃，保温时间多以 510 分钟为度，在啤酒厂习惯用 10 分钟作为测定的保温时间。 三 、实验材料 菌种 酿酒酵母（ Saccharomyces cerevisiae）和热带假丝酵母（ Candida tropicalis）。 培养基 1214oBrix 麦芽汁。 （见实验四或附录） 仪器和器具 恒温水浴箱、恒温箱、无菌移液管、计时表、温度计、酒精灯、酒精棉球。 四、实验方法 取盛有 5mL 的灭菌麦芽汁（ 1214oBrix）试管一组，每管用无菌吸管接入用麦芽汁培养 24 小时后的酵母悬液 ，取已接种的试管 3 支浸入 40℃中保温，其中 1 支管中插入温度计，另两支 不插，当插温度计的试管温度达到 40℃时，开始记录时间，并保持 10 分钟，立即拿出，放到冷水中冷却。 然后用同样的方法测定其它温度，如 42℃、 44℃、 46℃、„„以至 60℃再将各组试管置 25℃保温箱中，培养后观察。 五、实验结果 在一周培养时间内，不能产生发酵现象的最低温度，就是该酵母的热死温度。 但通常情况下，则以此测得的最低温度加 12℃为该酵母的热死温度。 如酵母在52℃保温 10 分钟培养后没有发酵现象，则该酵母的热死温度为 5354℃。 酵母热死温度的改变，说明菌种发生变异，或受野生酵母的污染（野生酵母比培养 酵母有更高的耐热性），检查所使用的酵母是否被污染，这也是啤酒巴氏灭菌确定温度的依据。 国内各啤酒厂所使用的啤酒酵母热死温度多为 52℃。 六、思考题 什么是热死温度。 酵母的热死温度的影响因素有哪些。 若酵母的热死温度发生改变，则引起的原因是什么。 实验八 酵母菌凝集力的测定 一、实验目的和要求 了解酵母菌凝集力的测定原理与应用； 学习酵母菌凝集力测定的操作技术。 二、实验原理 啤酒酵母菌及葡萄酒酵母菌的凝集性在生产上具有特殊的重要性，也是区别菌株的一项重要内容。 由于凝集性的不同，酵母菌的 沉降速度就不一样，发酵度也有差异，如果酵母菌菌种发生变异或污染了野生酵母时，则会改变其凝集性，给生产带来困难。 三、实验材料 菌种 酿酒酵母（ Saccharomyces cerevisiae）和糖化酵母（ Saccharomyces diastaticus）。 培养基 麦芽汁培养基。 （见实验四或附录） 试剂和器具 pH 值为 的醋酸缓冲液，刻度离心管、接种环、离心管、离心机、无菌水、酒精灯、计时器等。 四、实验方法 将试验的酵母菌接种于麦芽汁发酵瓶中， 25℃培养 7 天，取培养 液装于离心管中，离心（ 3500 转 /分， 15 分钟）收集酵母细胞，然后用无菌水洗涤 23 次。 取酵母泥，准确称量 1g，放于刻度离心管中，然后加入 10mL 醋酸缓冲液（ pH 值 ），摇匀，使其成悬浮状态。 在 20℃水浴中静置 20 分钟，再将此悬液连续摇动 5 分钟，使酵母重新悬浮，再静置，在 20 分钟内每分钟记录一次沉淀酵母菌的容积。 五、实验结果 一般，将 10 分钟时酵母菌沉淀的容积称为本斯值。 通过此值可估计酵母菌的凝集性，沉淀容积为 以上者为弱凝集性，而为 以下者为弱凝集性。 上述的试验前后要求悬浮液的 pH 值不变。 六、思考题 酵母菌的凝集性在生产上的特殊重要性是什么。 若酵母的凝集性发生改变，则引起的原因是什么。 第二节 微生物育种 开发微生物资源的关键是获得所需要的菌种，优良的微生物菌种是工业微生物技术的关键和基础。 理想的工业发酵菌种多数是通过育种手段得到的。 选育优良的生产菌种并保持其稳定的生产特性，是发酵工业中极其重要的工作。 自然选择、人工诱变、原生质体融合等，尤其是诱变育种，在微生物菌种选育中曾经发挥极其重要的作用，现在仍然是重要的选育手段。 实验一 紫外线诱变育种 —— 绘制细胞存活 率和突变率曲线 一、实验目的和要求 进一步理解诱变剂对微生物的杀菌和诱变双重生物学效应； 学习紫外线诱变的方法及测定诱变剂最适剂量的方法。 二、实验原理 紫外线的生物学效应主要是它能引起 DNA 结构变化造成的。 紫外线具有杀菌和诱变双重生物学效应。 随着照射时间的增长，杀菌率和突变率随之提高。 但照射继续增加到一定程度时，其杀菌率也随之增大，而突变率却降低。 紫外线强度单位（剂量）为尔格 /毫米 2。 由于测定困难，在实际诱变育种中，常采用紫外线照射时间或细胞的死亡率表示相对剂量，其中以细胞死亡率表示方法具有实际 意义。 本实验以枯草芽孢杆菌腺嘌呤缺陷型菌株（ ade）为出发菌株，以营养缺陷型的回复突变作为诱变效应的指标，测定紫外线诱变剂的最适剂量。 以照射时间为横坐标，以细胞存活率或死亡率和突变率为纵坐标作图，突变率最高值相对应的细胞死亡率即为最适剂量。 三、实验材料与仪器 菌种 枯草芽孢杆菌腺嘌呤缺陷型菌株（ ade）。 培养基 肉汤培养基，细菌基本培养基。 试剂和器具 生理盐水，诱变箱，磁力搅拌器，涂布器，离心管，培养皿等。 四、实验方法 菌体 培养 取斜面菌种一环，接种于盛有 20ml肉汤培养基的 250ml 三角瓶中， 37℃ 振荡培养 6－ 18h，取 1ml 培养液转接于另一盛有 20ml 肉汤培养基的三角瓶中， 37℃ 振荡培养 6－ 8h，使细胞培养处于对数增殖期状态。 细胞悬浮液的制备 取 10ml 培养液，离心（ ， 10min）收集菌体。 沉淀用 10ml 生理盐水洗涤离心 2 次。 然后将菌体充分悬浮于 12ml 生理盐水中。 活菌计数法测定细胞悬浮液浓度 取 1ml细胞悬浮液，逐步稀释为 10－ 10－ 10－ 3„„。 取最后 3 个稀释度菌液各 1ml，置于平皿中，然后倾入 15ml融化并冷却至 45－ 50℃ 的肉汤固体培养基，充分地混匀，凝固后置于 37℃ 培养1－ 2 天，计数每平皿菌落数（每个稀释度作三个平行）。 按下式计数每毫升细胞悬浮液菌体浓度。 细胞数（个 /毫升）＝菌落数（三平皿平均值）179。 稀释倍数 诱变处理 （ 1）取 10ml 菌液于直径 90mm 培养皿中（带有磁棒），将皿放置于诱变箱的磁力搅拌器上。 （ 2）开启紫外线灯，预热 20min 后，开启磁力搅拌器，打开皿盖，分别照射 1 4 60、 7 90s）。 （ 3）取不同时间诱变处理菌液 1ml，按照 3 的方法作适当稀释，测定处理液中存活细胞浓度（每时间作 3 个稀释度，每个稀释度作 3 皿平行）。 结果填入表 1。 （ 4）取（ 3）中同样的稀释菌液毫升，置于平皿中，倾入融化并冷却至 45－ 50℃的细菌基本培养基 15ml，充分混匀，凝固后置 37℃ 培。