第三章核酸技术

第三章核酸技术内容摘要：

肽链 抗体复合物 不溶性交联抗原基 质亲和层析柱吸附 洗脱 免疫沉淀法优点：可分离到含量仅为 1%的 mRNA，但必须使用高纯度的抗体，不能发生交叉反应和污染核酸酶 2) 多聚核糖体 RNA的分离 纯化多聚核糖体 +SDS 蔗糖密度梯度离心或蛋白酶 K苯酚抽提 4. RNA的分级分离 1) 分子量大小分级分离 i. 蔗糖密度梯度离心 ii. 凝胶电泳 2) 核酸序列分级分离 i. 分子杂交法：适用于同源性很高的 RNA的分离 DNA分子变性 结合到 NCF RNADNA杂交 洗涤 洗膜 乙醇沉淀 ii. 亲和层析法： 低聚 dT纤维素 : 用于 poly(A)较长的 mRNA； 多聚 U琼脂糖 : 用于 poly(A)较短的 mRNA（ 20A） RNA进样吸附 洗涤 洗脱 收集 260nm处吸收峰样品 乙醇沉淀 iii. 无 poly(A) mRNA的分离 纯化多聚核糖体 核糖体亚基 +mRNP 离心 mRNP 蛋白酶 K mRNA 低聚（ dT）纤维素层析 洗出液 乙醇沉淀（无多聚 A mRNA） 5. RNA的质量评估方法 1) 光密度值测定法 A260/A280= 2) 凝胶电泳 3) 体外蛋白质翻译 细胞裂解物 胍盐法 总 RNA 分子杂交法 — 特异 RNA分子 热苯酚法 凝胶电泳 围 RNA 大小分级分离 大小范 蔗糖密度 梯度离心 一定 LiCl/ 核酸序列 尿素法 离心 分级分离 亲和层析法 — poly（ A） RNA分子 高速离心法 全部多聚核糖体 上清液 镁盐沉淀法 蔗糖密度梯度离心 — 结合与 游离多聚核糖体 分级分离法 蔗糖连续密度 — 一定范围大小核糖体 多聚核糖体 RNA 免疫沉淀法 —— 特异性多聚核糖体 第二节 核 酸 电 泳 1. 种类 1) 按凝胶材料分 : 聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶电泳 (普通琼脂糖和低熔点琼脂糖 ) 2) 按电泳装置分 : 水平式 /琼脂糖凝胶。 竖式 /聚丙烯酰胺凝胶 3) 两种方法比较：分离效果和分离范围。 操作难易 2. 用途 琼脂糖凝胶用于 DNA和 RNA的常规分析；聚丙烯酰胺凝胶常用于小分子核酸分析。 3. 凝胶电泳的一般程序 制胶 点样 电泳 染色 观察 二 、 DNA电泳 1. DNA分子种类 1) 线状 DNA— 单链与双链 ， ssDNA电泳时要注意局部区域形成 dsDNA， 造成迁移距离不确定 2) 环状 DNA— 单链 （ 如 M13mp） 和双链 （ 质粒 DNA） 3) 线状 dsDNA电泳 — 使用频率最高的一种电泳 这类 DNA分子在电泳过程中迁移的距离受以下几个因素的影响： i. 分子量 的大小 : 迁移距离与分子量的 常用对数 成反比 ii. 凝胶浓度 : 浓度越高，移动距离越短，适合分离低分子量DNA浓度越低，移动距离越长，适合分离高分子量 DNA : 低电压时，迁移率与电压成正比；电压增高时，不同大小 DNA片段迁移率增大是不同的。 : 不受影响 ,温度高可导致 DNA带变形或解链。 4) 环状 dsDNA电泳 : 常用于质粒 DNA的初步鉴定 5) 线状 ssDNA电泳 链分离凝胶 ：化学定序时，用于单链分离。 DNA双链互补，但组成不一样，仍可分离（机理不详），电泳时形成三条带：变性双链，两条单链。 核酸定序凝胶 (染料指示剂 )：为避免局部区域产生二级结构，可采用各种变性措施，如煮沸样品，提高电泳温度，凝胶中加入变性剂（尿素、甲醛、甲胺等） 三 . RNA凝胶电泳 方法：不同的 RNA电泳方法是依据使 RNA分子变性所采取的方法。 这些方法不仅要使 RNA分子在点样时是一级结构，。