第七章亲和层析

第七章亲和层析内容摘要：

质溶液 )混合，缓慢搅拌 (勿用磁力搅拌器 )2h(室温 )或过夜 (4℃ )，以便 配体和基质 充分偶联 而 形成 固相载体。 图 74是 植物血球凝集素 (如 ConA)Sepharose4B亲和吸附剂的制备流程 (供参考 )。  3． 配体结合量的测定 配体结合量：一般是用每毫升或每克贮存胶束缚配体的量表示的。 如用 mg／ m1表示。 测得的配体结合量 ， 可 作为决定亲和吸附剂实际用量的参数。  具体测定方法有两种，即直接测定法和间接测定法。 • (1)直接测定法 ① 2， 4， 6— 三硝基苯磺酸钠的颜色试验 ② 根据配体的特性进行测定 • (2)间接测定法 ① 推算法 一般情况下，从 加入配体的数量 中 减去 配体与活化琼脂糖偶联后 洗涤出来的配体量 ，即可大致推算出配体的结合量。 ② 根据亲和吸附剂对被吸附物质的操作容量可计算配体的结合量 其方法有： 一是把亲和吸附剂 装入柱 ( 10cm)内， 加入 过量的欲分离 大分子物质 ，使其结合量达到最大，用适当的洗涤剂彻底 洗去 非专一性的物质，然后再用特异的 洗脱剂 洗出欲分离的大分子物质。 根据分离出的大分子物质的量，计算出配体的结合量。 二是把少量纯品大分子物质陆续加到亲和层析柱中，直到饱和平衡为止，根据上样量即可推算出配体的结合量。 四 、 特异性吸附  大分子物质在亲和层析柱中的吸附过程 如图 75所示 当样品开始加到已知具有一定配体浓度的亲和层析柱 (A)时 ， 欲分离的大分子物质在柱中的浓度等于零； 当样品开始进入柱中时 ， 配体和欲分离的大分子物质间相互接触 ， 并 形成 复合物 ， 但也 有部分 复合物分解 ； 当 样品不断地通过柱子时 ， 欲分离的大分子物质与配体之间形成的复合物 浓度越来越大。 也就是说 ， 随着样品不断地通过柱子 ， 欲分离的大分子物质的浓度会恒定地增加 (B)。 由于配体的存在使欲分离 大分子物质的移动受到 阻碍 ， 从而导致产生紧密的 复合物带 (C)。  样品中 有效成分 在亲和吸附剂上的 吸附量 ， 与它们之间的 亲和力 有密切关系 ， 还与样品的 pH值 和 离子强度 有关系。 五 、 分离大分子物质 （ 洗脱 ）  除去杂质 样品过柱后 ， 可用大量的 平衡液 即起始缓冲液 洗去 无亲和力的 杂蛋白 ， 有时也可用 不同的缓冲液 洗涤去除之； 最后留在柱上的只有专一吸附的大分子物质。  洗脱有效成分 将柱上专一吸附的大分子物质洗脱下来。 洗脱液要能使复合物完全分离，其具体作法可根据亲和力决定： • ① 亲和力 比较小时 ， 可以连续用大体积 平衡缓冲液洗脱 ， 得到迟缓的大分子物质峰。 • ② 亲和力 一般时 ， 主要靠 改变缓冲液的性质 (如改变pH值或离子强度 ， 或者同时改变 pH值和离子强度 )，使复合物之间的 亲和力下降 到足以分离的程度。 • ③ 亲和力 较强时 ， 可用 与配体竞争的溶液 或者用 蛋白质 变性剂 洗脱。 A． 竞争性洗脱剂 这类洗脱剂的优点是专一性强 ， 并能洗脱出和配体特异结合的大分子物质。 B． 剧烈的洗脱条件 (蛋白质变性剂 ) 如用盐酸胍 、 尿素等变性试剂配制的溶液洗脱下的蛋白质等生命大分子物质；需要经过适当的处理方可恢复活性。 六 、 亲和层析柱的再生  当洗脱结束后 ， 应连续用大量的 洗脱液 或 高浓度的 盐溶液 彻底洗涤柱子 ， 接着再用 平衡缓冲液 使层析柱 重新平衡。  经过这样处理的柱子可再次上样 ， 进行第二次亲和层析。  一般亲和层析柱都可以反复使用多次。 第。