rnai的发现

rnai的发现内容摘要：

内源基因却缺乏转移性沉默，表现出沉默区域的保守性。 这两种现象在线虫中也有发现 ,但在哺乳动物和昆虫中却没有发现类似的现象。  植物中的 RNAi跟两种不同大小的 siRNA有关： 21nt和24ntsiRNA， 21nt由 RISC指导切割目的 mRNA，而 24nt则引发了系统性沉默和甲基化；而在动物中仅发现 21nt的siRNA。 RNAi研究的一般技术路线 制备 siRNA 的方法 （ 1）化学合成  尽管化学合成是最贵的方法 ， 但是却是最方便的 —— 研究人员几乎不需要做什么工作。 许多公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成 siRNA。  主要的缺点包括价格高 ， 定制周期长 ， 特别是有特殊需求的。  由于价格比其他方法高 ， 为一个基因合成 3— 4对 siRNAs 的成本就更高了 ， 比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。  最适用于： 已经找到最有效的 siRNA的情况下，需要大量siRNA进行研究；  不适用于： 筛选 siRNA等长时间的研究，主要原因是价格因素 （ 2）体外转录  相对化学合成法而言成本比较低 ， 是一种性价比高的筛选 siRNAs的好方法。  更重要的是能够更快的得到 siRNAs。  值得一提的是体外转录得到的 siRNAs只要较低的浓度就可以达到化学合成 siRNAs较高浓度得到的效果。  不足之处：实验的规模受到限制 ， 虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的 siRNAs， 但是反应规模和量始终有一定的限制。  最适用于： 筛选 siRNAs， 特别是需要制备多种siRNAs， 化学合成的价格成为障碍时。  不适用于： 实验需要大量的 ， 一个特定的 siRNA。 长期研究。 Figure. Use of Chemically Synthesized and in Vitro Transcribed siRNAs targeting 223。 Actin to Induce Gene Silencing. （ 3） 用 RNase III 消化长片断双链 RNA制备 siRNA  选择通常是 200— 1000碱基的靶 mRNA模版，用体外转录的方法制备长片断双链dsRNA  RNase III (or Dicer) 在体外消化，得到一种siRNAs  除掉没有被消化的 dsRNA  siRNA混合物直接转染细胞  最适用于： 快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型  不适用于： 长时间的研究项目 ， 或者是需要一个特定的siRNA进行研究 ， 特别是基因治疗 Ku70 levels were reduced 86% in cells transfected with the siRNA cocktail, pared to nontransfected controls. （ 4） siRNA表达载体  多数的 siRNA表达载体依赖 3种 RNA聚合酶 III 启动子(pol III)中的一种 ， 操纵一段小的发夹 siRNA在哺乳动物细胞中的表达。 包括的人源和鼠源的 U6启动子和人H1启动子。  之所以采用 RNA pol III启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子 RNA， 而且它是通过添加一串 （ 3到 6个 ） U来终止转录的。  使用这类载体，需要 2段编码短发夹 RNA序列的 DNA单链，退火，克隆到相应载体的 pol III 启动子下游。  最适用于： 已知一个有效的 siRNA序列，需要维持较长时间的基因沉默，或者需要用抗生素筛选能表达siRNA的细胞。 长期研究。  不适用于： 筛选 siRNA序列（其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作） （ 5） siRNA表达框架  siRNA表达框架 (siRNA expression cassettes， SECs)是一种由 PCR得到的 siRNA表达模版 ， 能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。  这个方法最早是由 Castanotto采用 ， 包括一个 RNA pol III启动子 ， 一段发夹结构 siRNA， 一个 RNA pol III终止位点。