生物技术制药重点及名词解释

生物技术制药重点及名词解释内容摘要：

IgG 或 IgM 作为二抗用于 ELISA)亚类的确定需要用标准抗亚类血清系统做双扩散电泳或夹心 ELISA。  其他鉴定： 中和活性鉴定；识别抗原表位鉴定；亲和力鉴定；效价 (滴度鉴定 )；纯度鉴定  杂交瘤细胞的鉴定：主要是对杂交瘤细胞进行染色体分析 抗体治疗疾病的机制 ：中和作用、导向作用、拮抗作用、 ADCC、 CD、 Aonist 抗体在疾病治疗中的应用  作为诊断试剂： 病原微生物抗原抗体的检测、肿瘤抗原的检测、免疫细胞及其亚群的检测、激素测定、细胞因子的测定  作为治疗药物： 抗肿瘤、抗感 染、抗器官移植排斥反应、治疗自身免疫性疾病和变态反应性疾病 制约抗体药物迅速发展的主要障碍 ：免疫原性；分子量大 基因工程抗体  单克隆抗体的人源化  嵌合抗体： 人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒定区融合而得到的抗体。 特点： 具备亲本鼠源单抗相同的特异性和亲和力；对人的免疫原性大大减少；可以接上不同亚类的人 C 区基因，改变抗体功能；半衰期长；工程细胞系比人－人杂交瘤细胞稳定；由于鼠 VL 和 VH 区的存在，仍有较强免疫原性  改形 (型 )抗体： 把鼠抗体的 CDR 序列移植到人抗体的可变区内，所得到的抗体称 CDR 移植抗体或改形抗体，也就是人源化抗体。 ，抗体的免疫原性极低，而其抗原结合能力保持不变，  小分子抗体  包括 Fab、 Fv、单链抗体及单域抗体等  Fab 片段 ：由重链 V 区及 CH1 功能区与完整的轻链以二硫键连接而成。 1/3  Fv 片段： 由 VH 与 VL 非共价结合而成。 在 VH 与 VL的适当区域个引入一个半胱氨酸，形成链内二硫键，成为 二硫键稳定的 Fv(disulfidestablized Fv， dsFv)1/6  单链抗体 (ScFv)：在 VH 与 VL 之间加上一段连接肽，把 VH 与 VL 连成一条单链，即 单链抗体。 常用的 连接肽是 (GGGGS)3  单域抗体： 即为 VH 或 VL，约为完整分子的 1/12。 它只由一个结构域构成，故称单域抗体。 单域抗体尽管亲和力有所降低，但仍保持着原单抗的特异性。  优点 ：可以用细菌发酵生产，成本低；分子小，穿透力强；不含 Fc，没有 Fc 带来的效应；在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出；易于与毒素或酶基因连接，便于直接获得免疫毒素或酶标抗体等。  多功能化抗体  双功能抗体 (bsAb)： 又称双特异性抗体，两个针对不同抗原决定簇的 ScFv 以共价键或非共价键连接在一起。  融合抗体： Fc 抗体融合蛋白； Fv 抗体融合蛋白  细胞内抗体： 指在细胞内合成并作用于细胞内组分的抗体，也称内抗体。 在 scFv 的 C 端 /N 端插入其他靶向信号  最小识别单位： 约为完整分子的 1/801/70 大小，一般由一个 CDR 构成，它也保持着抗体的特异性 噬菌体抗体工程 噬菌体抗体库技术的三个关键 ： RTPCR 技术；噬菌体展示技术；抗体原核表达技术。 ★ 噬菌体抗菌库技术的筛选 ：。 固相或液相纯化抗原的筛选、全细胞筛选、用切片组织进行筛选 第五章 疫苗及其制备技术 (live vaccine)选用无毒或弱毒但免疫原性高的菌种，经培 养、繁殖后制成的。 活疫苗株进入机体后，能继续生长繁殖，对机体呈长时间刺激，持续产生抗体。 这类菌 (疫 )苗有 卡介菌 (预防结核病的菌苗 )、 炭疽菌苗 、 牛痘疫苗 、狂犬病疫苗、 鼠疫菌苗 、 脊髓灰质炎疫苗 以及 麻疹苗 等。 (killed vaccine)包括 灭活疫苗 (由完整的病毒或细菌经灭活剂灭活后制成，即要使病原体充分死亡，丧失感染性或毒性和致病性，又要保留其免疫原性 )和 亚单位疫苗 (将病原体经物理或化学方法处理，除去无效物质，提取其有效抗原部分制备的一类疫苗 ) ★活疫苗特点★ ★死疫苗特点★  可在体内繁殖  系 统免疫反应和局部免疫反应  免疫力持久 ，产量高， 成本低  有毒力增强和反祖危险  抗原干扰现象  保存条件苛刻  不能在体内繁殖 ，性质稳定， 安全性高  有利于制备多价或多联疫苗  比较安全，不发生全身性副反应，无毒力反祖现象  受外界影响小，有利于保存运输  免疫剂量大， 需多次免疫，成本高  只能诱导机体产生体液免疫  通常 需要用佐剂或携带系统来增强其免疫效果 ★ 活疫苗 ★ 死疫苗 DNA 疫苗  可在宿主细胞中复制  毒力降低  免疫反应比较全面  免疫剂量小  免疫保护期长  不能在宿主细胞中复制  无毒，不返强  免疫反应不太全面  不会 传染给其它个体  制备技术相对容易  可刺接抗原在细胞内合成  可诱导细胞免疫  制备技术容易标准化 重组亚单位疫苗  将病原的 主要保护性抗原蛋白基因 在体外进行大量表达，纯化其表达产物辅以 佐剂 制成疫苗 亚单位疫苗  良好的安全性和稳定性。 利用非疫苗用蛋白作为抗原建立的诊断方法将可以区分 亚单位疫苗免疫的动物 和自然感染的动物  适用于发病快，病程急，中和抗体能有效控制发病的传染病。  不适于病程发展缓慢，潜伏期长，感染巨噬细胞且有 ADE 效应的疾病。 活载体疫苗  利用低致病力的 痘病毒、疱疹病毒、腺病毒或细菌 作为载体，将 其它病原的主要保护性抗原基因插入到载体基因组的非必需区形成新的重组体，在同源或兼容性好的启动子驱动下随载体的复制表达插入的外源基因。 病毒活载体疫苗的缺点 ： 使用同一载体的不同疫苗不能同时使用 疫苗制造流程 制造优良疫苗的关键： 优良的菌种；适宜的培养方法；良好生产工艺；严格的检验和标准。 生产工艺流程： 菌 (毒 )种→培养物 (培养基、动 物、禽胚或细胞等 )→收获抗原 (培养液、含毒组织、胚液或细胞液等 )→配苗→分装→冻干成活疫苗或灭活后制成灭活疫苗。 毒种的选择与减毒 ★ 毒株须具备的条件： 1) 持有特定 的抗原性； 2) 有典型的形态和感染特定组织的特性，并能保持其生物学特性； 3) 易在特定组织中大量繁殖； 4) 不产生神经毒素或能引起机体损害的其它毒素； 5) 如制备活疫苗，繁殖过程中无恢复原致病性的现象； 6) 未被其它病毒污染。 强毒种的选育： 毒力强，纯粹，抗原好，稳定的菌种 ，最后冻干保藏。 这就是 强毒菌种的标准 弱毒种的选育： 初选的依据：生物性状改变 细菌灭活疫苗制造 ： 种子→培养→灭活和无菌检查→浓缩提高含菌量→配佐剂→分装→动物安全试验 细菌弱毒疫苗制造： 菌种→培养→浓缩→配苗和冻干→动物安全试验 病毒性动物组织苗 (自家组织 灭活苗；病毒弱毒疫苗 )、 病毒禽胚疫苗 、 病毒细胞疫苗 、 寄生虫疫苗的制备 ★ 疫苗产品的质量检定 ： 外观检查、 pH 值检测、纯度、宿主细胞 DNA 和蛋白残留量、无菌检查、热原、抗生素检测、灭活效果的验证、异常毒性检查、稳定性试验、效力试验 (生物效价 )、佐剂的质量评价、疫苗标准品或参考品的研究 甲型肝炎减毒活疫苗 ： 生产用细胞 (人二倍体细胞 )、细胞库管理及检定、细胞制备、细胞培养液、毒种名称及来源、种子批的建立、对照细胞外源因子检查、病毒接种和培养、病毒提取 (检定合格的病毒收获物经冻融和 (或 )超声波处理，并采用适宜浓 度的 三氯甲烷 抽提以提纯病毒 )、原液 (同一细胞批生产的病毒收获物经提取病毒后合并为 一批原液 ) 流行性乙型脑炎疫苗 ：收液作毒力滴定与无菌实验， 加入福尔马林， 22℃恒温灭活 8d 灭活剂、保护剂和免疫佐剂 灭活剂种类 1. 甲醛溶液 ：最常用。 ①蛋白质 ②核酸烷基化 (不加中断剂 )作用于氨基、羧基、羟基、巯基 2. 烷化剂 ：乙酰基乙烯亚胺 (AEI)；二乙烯亚胺 (BEI)； 缩水甘油醛。 (使微生物核酸烷基化 ,灭活后加 2%硫代硫酸钠中断灭活 )。 烷化 DNA 分子中的鸟嘌呤或腺嘌呤等，妨碍 RNA 的合成。 使病毒完全丧失感染力 ，而保留其保护性抗原。 3. 苯酚 (石炭酸 )：用于防腐， 很少用于疫苗研制 4. 结晶紫 ：蛋白质变性 (溶于有机溶剂 )；用于诊断抗原的制备：鸡白痢抗原 5. β丙酰内酯 ： 病毒灭活剂，主要用于狂犬病灭活苗制备。 注意 ：灭活剂对人有害， 有时对皮肤粘膜有强烈刺 激性如：甲醛、β 丙酰内酯 影响灭活作用的因素 ： 灭活剂特异性；微生物种类和特性；灭活剂浓度；灭活温度；灭活时间；灭活 PH 值；有机物存在 保护剂的用途 ① 菌种或毒种保存：常用甘油作保护剂 ② 细胞株保存：常用二甲基亚砜 (DMSO，一种细胞的保护剂 ) ③ 疫苗冷冻真空干燥制备时：加脱脂乳 (或二甲基亚砜 )和蔗糖等 (不同国家有不同配方 ) ④ 干扰素类生物活性物质的保存：加葡聚糖 保护剂分类： 机理 —— 渗透剂 (DMSO、甘油和蔗糖 )非渗透剂 (聚乙烯吡咯啶酮 (PVP)和蛋白质 )； 分子量大小—— 高分子物质、低分子物质； 化学性质 —— 复合物、糖类、盐类、醇类、酸类和聚合物 疫苗冻干保护剂组成 ：营养液；赋形剂；抗氧化剂 常用的冻干保护剂 (稳定剂 )  细菌的保护剂 ① 需氧或兼氧厌氧菌： ５％蔗糖脱脂乳 或 ５％蔗糖、 ％明胶 ； ② 厌氧性细菌：含 ％谷氨酸钠的１％乳糖或 10％脱脂乳或 ％葡糖血清。 注：脱脂乳： 20％脱脂奶粉溶于水配制而成。  病毒的保护剂 ① 5%蔗糖脱脂乳； ②马立克 814 活细胞疫苗：保存液氮 .稳定剂为 10%二甲基亚砜和 50%犊牛血清的 199 液。 注 : 微生物保护剂缓冲液的组成比例，不同厂家有不同的配方。 常用的保护剂： 5%蔗糖 (乳糖 )脱脂乳保护剂 ；明胶蔗糖保护剂； SPGA 保护剂 免疫佐剂：  氢氧化铝胶 (铝胶 ) •油乳佐剂 •乳化剂 •白油佐剂 •蜂胶佐剂 •脂质体佐剂  细胞因子类免疫 佐剂 (IL IL IL1 IFNγ)  CpG DNA(指含有非甲基化 CpG(胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸 )基序的脱氧核糖核酸 DNA)  CpG OND(含有非甲基化 CpG基序的寡聚脱氧核苷酸 )  基因工程减毒素 (霍乱毒素， CT；大肠杆菌不耐热毒素， LT；破伤风类毒素， TT)  免疫刺激复合物 (ISCOM，抗原：糖苷 Quil A：胆固醇 =1:1:1) 作用机理： 抗原递呈；抗原寻的；免疫调节  CpGDNA 对多种免疫细胞有激活作用： 引起 B 细胞分化，直接激活单核细胞、巨噬细胞和树突细胞，在 IL12 协同下激活 NK 细 胞，协同刺激抗原特异性 B细胞和 T 细胞分化  CpGODN 的体内效应与应用： 对天然免疫系统的刺激活性 (抗感染、抗肿瘤活性 )；对特异性免疫反应的调节作用 —— 疫苗佐剂 (对蛋白质抗原的作用；对 DNA 疫苗的作用 )；过敏性疾病治疗 第六章 酶工程制药 概述 酶是一类具有催化活性的生物大分子，包括蛋白质和核酸 一般催化剂的特征 ： ； ，而不改变反应的平衡点；。 ★ 酶的特点 ： 高效性、专一性、反应条件温和、可调节性。 酶的分类 ： 六大类， 氧化还原酶类 (脱氢酶、氧化酶、过氧化物酶、羟化酶以及加氧酶类 )、转移酶类、水解酶类 (淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶 )、裂解酶类 (醛缩酶、水化酶及脱氨酶 )、异构酶类 (消旋酶、顺反异构酶 )和 合成酶类 (又称为连接酶 ) 酶的来源和生产 ： 直接从动植物获得，即从生物体中分离和提纯；化学合成方法；工业微生物发酵 发酵法产酶的优点 ：微生物种类繁多，制备出的酶种类齐全。 微生物繁殖快，生产周期短，酶的产量高，成本低。 微生物具有较强的适应性和应变能力，可以通过适应、诱导、诱变以及基因工程等方法培育出新的高产酶 的菌株。 研究内容 ： 酶的大量生产和分离纯化；新颖酶的发现、研究和应用；酶的固定化技术和 固定化酶反应器 ；基因工程技术应用于酶制剂的生产；酶分子改造与化学修饰；有机介质中酶的反应；酶抑制剂、激活剂的开发及应用研究；抗体酶、核酸酶的研究；模拟酶、合成酶的研究；酶的定向进化研究 酶的分离纯化 分离纯化遵循蛋白质分离纯化的一般原则，但又有特殊性：  低温：一般 1～ 4℃  条件温和：避免极端条件 (剧烈搅拌、 pH、盐浓度等 )  加入保护剂： EDTA、 2巯基乙醇等  对纯化过程进行监测：不断检测酶活力和蛋白浓度 ★ 酶 分离纯化的步骤 ： 预处理→初步纯化→高度纯化→浓缩与干燥  酶的提取  来源选择 ： 含目的多的原料。 同时考虑原料的来源、取材方便经济等方面因素  细胞破碎 ：机械法、物理法、化学法 (有机溶剂、表面活性剂 )、生物法 (酶解 )  保护措施： 采用缓冲系统；添加保护剂；抑制水解酶的作用；其他：注意温度、搅拌、紫外光等的影响  酶的抽提：。