基因工程复习重点和课后题答案

基因工程复习重点和课后题答案内容摘要：

7 、 JM10TG XL1Blue 2 质粒 M13 杂交载体 ：含有单链噬菌体包装序列、复制子以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体，集质粒和丝状噬菌体的有利特征于一身的载体。 特点：能像M13DNA 那样体外包装，并高效转染受体细胞，能像质粒那样在受体细胞中自主复制，装载量比常规的 M13mp 系列要大很多（ 10 kb），通过克隆双链 DNA 能获得同等长度的单一单链 DNA。 2 重要的噬菌粒载体： pUC118 / 119： pUC118 pUC18 + M13 间隔区 IG； pUC119 pUC19 + M13 间隔区 IG 2 pEMBL8 噬菌粒：在 pUC8 中插入了一个 1300bp 的 M13 基因组。 含有将双链分子转化为单链分子的酶识别位点。 可以以质粒的形式复制，也可以包装，以噬菌体的方式复制。 可克隆 10kb 的 DNA 片段。 2 P1 噬菌体基本结构与特征：（ 1） 基因组长 88 kb, 在噬菌体颗粒中的 DNA 长 100 kb, 呈线状 ,两端约有 12%的多余 DNA。 ；（ 2）基因组含 loxP 重组位点，由重组酶 Cre 催化。 在 rec+大肠杆菌中，末端冗余序列同源重组导致基因组环化；而在 rec大肠杆菌中只有含两个 loxP位点的 P1 噬菌体 DNA 才能环化，启动复制；（ 3） 可以低拷贝质粒形式存在于细菌细胞中（溶原状态） , 又可以烈性噬菌体形式进行复制（裂解生长）；（ 4） P1 噬菌体包装原理 : 渐进满头机制；底物 :：滚环复制过程形成的头尾相连多联体。 包装过程 : ①始于一个长 162bp的 P1 pac 位点，识别和切割此位点的是 P1 编码的 pacase，切出的 pac 一端进入预制头部，当其头部充满 DNA 后， DNA 再次被切。 第二次切割是随机的，无特异性 DNA 序列。 第二轮包装则从非特异性切割出的末端开始。 因此，多次包装都是从一个 pac 位点开始的。 P1 头部可容 110Kb。 ② pac 位点 : 一端含 4 个六聚体 (5’ TGATCA/G 3’ )，另一端则有三个，中间区域长 90 bp， pacase 切点位于靠近 90 bp 区的中心序列。 每个六聚体都有一个腺嘌呤甲基化位点 (dam→ GATC), pacase 只作用甲基化的 pac 位点。 5’ ( TGAmTCA/G )6N90 ( TGAmTCA/G ) 33’ 2 P1 载体优点： ①可克隆较大插入片段 ,，可插入 95Kb 外源 DNA，二倍于 cos 质粒载体； ② 较高的转化频率 , 1~2μ g 载体 + 2~4μ g 外源 DNA→ 105转化子 ③ 与 YAC 载体相比，它易于产生多拷贝的基因组片段。 易于获得大量特定的克隆 DNA。 克隆过程更可靠。 克隆片段易于进行次克隆 2 P1 噬菌体载体构建基因组文库的示意图： pAd10 sacBⅡ — ScaI+BamHI — 长臂 + 短臂 —加入外源 — DNA 片段 — 重组 DNA 分子 — 离体包装 — 感染宿主细胞 2 宿主菌： NS3529 菌株基因型 recA， lacⅠ q， mcrABC， mrr； recA：防止插入 DNA片段内的同源重组，以免发生重排； lacⅠ q ： 抑制 P1 裂解复制子 的激活 , 使 P1 质粒复制子在细胞中以单拷贝形式存在，亦防止外源 DNA 分子重排； mcr 和 mrr：抑制富含 GpMeC或 ApMeC 插入片段的选择性丢失。 第二章：工具酶 核酸：核酸水解酶类（核酸内切酶、核酸外切酶）；核酸合成酶类（ DNA 聚合酶、 RNA聚合酶、逆转录、 DNA 连接酶）；核酸修饰酶类（甲基化酶、核苷酸激酶、磷酸酶核苷酸转移酶）。 限制性核酸内切酶概念：是一类能够识别双链 DNA 分子中的某种特定核苷酸序列（ 4—8bp），并由此处切割 DNA 双链的脱氧核酸内切酶。 限制性核酸内切酶：来源：原核生物； 性质：内切酶（即在核酸分子链的内部制造切口的酶）；功能：自我保护作用（降解不同源 DNA，而不降解同源 DNA。 细菌的限制和修饰系统（ R/M 体系））。 限制性核酸内切酶：（ 1）限制：限制性内切酶将侵入细菌体内的外源 DNA 切成小片断。 （ 2）修饰：细菌自身的 DNA 碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。 ① Dam 甲基化酶： GATC 腺嘌呤 N6 位置引入甲基；② Dcm 甲基化酶： CCAGG或 CCTGG 序列在第二个 C 上 C5 位置上引入甲基。 限制性内切酶的命名：按酶的来源的属、种名而定， 取属名的第一个字母与种名的头两个字母组成的三个斜体字母作主语表示，如有株名，再加上一个字母；其后再按发现的先后写上罗马数字。 限制性内切酶的类型： I 型限制性内切酶； II 类限制性内切酶； III 类限制性内切酶。 I 型限制性内切酶：（ 1）识别位点序列：未甲基化修饰的特异序列。 （ 2）切割位点：在距离特异性识别位点约 1000— 1500 bp 处随机切开一条单链。 （ 3）作用机理：是三亚基双功能酶，限制酶切与甲基化互斥，需 ATP、 Mg2+和 SAM（ S腺苷蛋氨酸）。 三亚基双功能酶：酶活性取决于识别序列甲 基化状态。 两条链均甲基化：既不限制也不修饰；两条链均未甲基化：限制即酶切；两条链半甲基化：修饰未甲基化的链。 III 类限制性内切酶：在识别位点下游 2426bp 切割 DNA，但反应需要 ATP、 Mg2+和 SAM（ S腺苷蛋氨酸）。 二亚基双功能酶 RMS 限制酶切与甲基化反应同时竞争。 10:、 II 类限制性内切酶：分离的第一个酶是 Hind Ⅱ。 （ 1）识别位点序列：未甲基化修饰的双链 DNA 上的特殊靶序列（长度，碱基的组成，多数是回文序列）与 DNA 的来源无关。 ① 大多数为回文对称 /旋转对称，② 非对称，③ 多识 别序列 (简并序列 )，④ 间断对称。 （ 2） 切割位点：酶切的结果：切开双链 DNA 形成粘性末端，平齐末端。 （ 3）粘性末端：含有几个核苷酸单链的末端。 ① 5’端凸出，即靠近 5’端切割（如 EcoR I 切点），② 3’端凸出，即靠近 3’端切割（如 Pst I 切点）。 （ 4）粘性末端的意义。 （ 5）同裂酶和同位酶。 （ 6）同尾酶。 （ 7）Ⅱ s 型限制性内切酶。 （ 8）归位内切酶。 （ 9）切口酶 1 粘性末端的意义：连接便利 ： i）不同的 DNA 双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。 这比连接两个平齐末端容易的多。 ii）同一个 DNA 分子内连 接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。 1 同裂酶和同位酶：识别位点的序列相同的限制性内切酶。 ① 同裂酶：同序同切酶（识别位点和切点完全相同）；② 同位酶：同序异切（识别位点相同，但切点不同）；③“同功多位” 许多识别简并序列的限制酶包含了另一种限制酶的功能。 1 同尾酶：识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。 同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。 1 Ⅱ s 型限制性内切酶：漂移切割：在离它的不对称识别位点一侧的特定距离处切割 DNA双链。 1 归位内切酶：是双链 DNA 核酸酶，能识别较 长的非回文序列（ 1240 bp），其编码序列位于内含子或内含肽中。 归位内切酶的命名延用了一般内切酶的命名原则。 内含子编码的归位内切酶加前缀“ I”；内含肽编码的归位内切酶加前缀“ PI”。 1 切口酶：有些限制酶只切割双链 DNA 中的一条链，产生单链缺口，称之切口酶。 1 三类限制性内切酶对比： I 型限制性内切酶（酶分子：三亚基双功能酶；识别位点：二分非对称；切割位点：无特异性至少在识别位点外 1000bp；限制反应与甲基化反应：互斥；限制反应需要 ATP）。 II 类限制性内切酶（酶分子：内切酶与甲基化酶分子不在一起；识别 位点： 46bp 大多数为回文对称结构；切割位点：在识别位点中或靠近识别位点；限制反应与甲基化反应：分开的反应；限制反应不需要 ATP）。 III 类限制性内切酶（酶分子：二亚基双功能酶；识别位点： 57bp 非对称；切割位点：在识别位点下游 2426bp；限制反应与甲基化反应：同时竞争；限制反应需要 ATP）。 1 影响限制性内切酶活性的因素：① DNA 的纯度：（纯化 DNA，加大酶的用量，延长保温时间，扩大反应体积（ 20μι）；② 缓冲液：是影响限制酶活性的重要因素（ MgClNaCl/KCl：提供 Mg2+和离子 强度； TrisHCl：维持 pH； 二硫苏糖醇（ DTT）：保持酶稳定性； 牛血清白蛋白 BSA 等：有助于酶的稳定）③温度：不同的限制性内切酶的最适反应温度不同，大多数是 37 oC，少数要求 4065 oC。 1 限制酶的酶活性：限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、 pH等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。 所以一般使用专一的反应缓冲液。 星号（ *）活性：如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号（ *）活性。 引起星星活性的因素 ：① 高浓度甘油（ 5%） ② 酶过量（ 100U/μ g）酶与底物DNA 比例过高③ 低离子强度（ 25mM） ④ 高 pH () ⑤ 有机溶剂 ⑥ 用其它二价阳离子代替 Mg++。 抑制星星活性的条件：① 减少酶的用量，避免过量酶切 ,减少甘油浓度 ② 保证反应体系中无有机溶剂或乙醇 ③ 提高离子强度到 100～ 150mM (如果不会抑制的话 ) ④ 降低反应 pH 至 ⑤ 使用 Mg++作为二价阳离子 2 位点偏爱：某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱性切割。 2 DNA 的甲基化程度： dam 甲基化酶（修饰 GATC 中的 A）； dcm 甲基化酶（修饰 CCA/TGG的 C）。 2 酶活性单位 (unit, U): 在建议使用的缓冲液及温度下，在 20μ l 反应液中反应 1 小时，使1μ g DNA 完全消化所需的酶量。 2 内切酶与识别序列的结合模式：①完全酶切：内切酶在 DNA 上的所有识别位点都被切开；②部分酶切：只有有限数量的酶切位点被切开。 通过缩短保温时间、降低反应温度或 2 减少酶的用量可达到局部消化的目的。 ③单酶切： 20μ l 反应体系： 13μ l 双蒸水 2μι10x buffer 、 4μ l DNA、 1μ l 内切酶；离心 2 秒混匀，最适反应温度 1～ 3 小时， 65℃保温15 分。 ④双酶切： a. 选用都合适的 Buffer or KGB ； b. 不可替代：先低盐 buffer，后加适量NaCl 和第二种酶 ； c. 先低温后高温（可纯化或不纯化）；注意事项 a. 取少量酶 (方法 or 稀释 ) b. 最后加酶、尽快操作 c. 减少反应体积 d. 反应时间的延长 e. 分装（对于多个反应）。 2 限制酶酶切反应的终止：大多数酶可用 65 oC 温育 5 分钟失活。 或用乙醇沉淀 DNA。 2 限制性核酸内切酶的应用：重组 DNA 前的切割；酶切受体 DNA；构建新克隆载体；构建 DNA 物理图谱；制备 DNA 探针； DNA 分子杂交； 亚克隆以用作序列分析；基因定位， DNA同源性研究。 2 DNA 分子的限制性图谱： DNA 分子上每一种内切酶识别序列的分布图 2 RFLP ：技术的原理是检测 DNA 在限制性内切酶酶切后形成的特定 DNA 片段的大小。 ①限制性内切酶酶切后；②电泳分离 DNA 片段；③转移至硝酸纤维素薄膜；④与放射性探针杂交，⑤分析阳性条带 两种 DNA 连接酶：（ 1）大肠杆菌连接酶：只能连接粘性末端。 （ 2） T4 噬菌体的连接酶：不但能连接粘性末端，还能连接齐平末端。 3 DNA 连接酶的连接条件：（ 1）必须是两条双链 DNA。 （ 2） DNA3’端有游离的 OH， 5’端有一个磷酸基团（ P）； 3‘ OH 对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出 AMP。 （ 3）需要能量：动物或噬菌体中： ATP ，大肠杆菌中： NAD+ 3 DNA 连接酶连接反应的温度：最佳温度：连接酶反应的最佳温度是 37 度。 实用温度 ：但在 37℃下粘性末端的结合很不稳定，所以一般采用 4~16 度。 3 影响 DNA 连接酶连接反应的因素：插入片段与载体的浓度比例（ 10~20 倍，增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象）；反应温度 （ ℃，一般 14~16℃）。 3 热稳定的连接酶：能在高温下催 化两条寡核苷酸探针发生连接用的一种核酸酶。 3 连接酶的应用：寡核苷酸连接测定（ OLA），连接酶链式反应（ LCR） 3 DNA 片段的连接策略：黏性末端、平末端、黏性末端＋平末端 3 互补粘性末端的连接：①同一种限制性核酸内切酶切割；②两种同尾酶切割。 3 不同粘性末端修饰成平末端后进行连接：核酸外切酶的作用方式是从双链 DNA 分子的一端（ 3′ 端或 5′ 端）单链部分开始，逐个水解切除核苷酸，使黏性末端成为平末端。 3 平端 DNA 片段的连接：多种情况出现平末端；。