基因工程原理复习重点

基因工程原理复习重点内容摘要：

’ 侧翼序列区，但也有的是位于转录区和 3’ 侧翼序列区。 增强子的功能作用： ① 成环作用； 增强子可影响模板附近的 DNA 超螺旋的密度（结构），诸如导致 DNA 超螺旋弯曲，或是在反式作用因子参与下，以蛋白质之间的相互作用为媒介，使增强子和启动子之间的 DNA“成环”的连接模式起始转录。 ② 固定作用 将模板固定在细胞内特定位置，如连接在核基质上，有利于拓扑异构酶改变 DNA 双螺旋结构张力，有利 于促进 RNA 聚合酶在 DNA 链上的结合与滑动。 ③ 引导作用 可以为反式因子或 RNA 聚合酶 II 提供进入染色体结构的“进入位点”。 20. 基因的分类 (1)按拷贝数分： 单拷贝基因， 多拷贝基因 (2)按产物类型分： 结构基因，调节基因 (3)按表达特性分：组成基因， 诱导 基因 (4)按实验用途分：选择基因，报告基因 (5)按排列组合特点分： 基因家族，基因簇 选择基因： 指可使被转化的细胞获得其亲本细胞所不具有的新的遗传特征，从而使得人们能够使用特定的 选择培养基，将转化的新细胞 (即转化子 )，从其亲本细胞群体中选择出来的一类特殊的基因。 报告基因： 特指其编码产物能被快速检测，常用来判断外源基因是否已经成功地导入寄主细胞、器官或组织的一类特殊基因。 21. 基因工程诞生的理论基础 (1)20 世纪 40 年代确定了遗传信息的携带者 (分子载体 )是 DNA 而不是蛋白质。 (2)20 世纪 50 年代的双螺旋结构模型与半保留复制机理 (3)20 世纪 50 末 60 初，科技工作者提出中心法则和操纵子学说，遗传密码的破译，阐明了信息流的方向。 22. 基因工程诞生的技术基础 (1)核酸 内切限制酶， DNA 的体外切割与连接， DAN 连接酶； (2)DNA 核苷酸测序技术； （ 3）基因克隆载体的发展与应用； （ 4）大肠杆菌遗传转化技术的建立； （ 5）琼脂糖凝胶电泳技术应用； （ 6）核酸杂交技术的应用。 23. 酶的分类 : 氧化还原酶类，转移酶类，水解酶类，异构酶类，裂解酶类，连接酶类。 24. 共线性的概念 （ 1）位于同一条染色体 DNA 或 DNA 分子上不同基因的位置排列关系 ； （ 2）不同物种中 DNA 的排列关系； （ 3）位于 DNA 分子及其转录本 RNA 分子间的共线性； （ 4） mRNA 密 码的顺序与蛋白质氨基酸顺序。 25. 切口（ Nick）： 在双链 DNA 的某一条链上两个相邻核苷酸之间失去一个磷酸二酯键所出现的单链断裂。 裂口（ Gap） :指双链 DNA 分子的某一条链上，失去一个或连续几个核苷酸时所出现的 DNA单链断裂。 DNA 连接酶无法封闭裂口。 26. 核算内切限制酶： 是一类能够识别双链 DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割 DNA双链结构的核酸内切酶。 27.Ⅱ 型核酸内切限制酶的特点 （ 1）与 Ⅰ 型、 Ⅱ 型不同，不具备多亚基的结构，可在没有修饰的情况下切割； （ 2）识别双链 DNA 分子的限 制位点； （ 3）切割位点发生两条链切割，形成互补黏性末端； （ 4）酶切反应不需要能量； （ 5）因两个单链切割部位是交错的，黏性末端互补。 （ 1） DNA 的分子特性 a 识别位点周围核苷酸碱基成分可影响其底物 DNA 消化的速率，有时达 25 倍； b 特定 DNA 分子中所具有的目标限制位点的密度 ； c 完全超螺旋 DNA 分子比线性 DNA 分子消化时需要更多的酶； d DNA 分子的甲基化程度，如果位点发生甲基化，会强烈干扰核酸内切限制酶的活性。 （ 2）酶切消化反 应的温度，大多最适温度为 37℃。 （ 3） DNA 制剂的纯度对酶切活性的影响 ，制剂中的污染物：酚，氯仿，蛋白质，酒精，甘油，高盐， SDS, EDTA 等； 29. 星号活性： 在反应条件发生变更的情况下，核酸内切限制酶便失去了切割其固有识别序列的能力，而会在新的识别序列上发生 DNA 分子切割。 这种发生了改变的限制酶活性，叫做星号（ *）活性，或限制酶星号活性。 产生星号活力的原因：（ 1）酶用量的单位数与 DNA 用量的比值过高，超过 10U/μ g；（ 2）甘油浓度不可超过 5%；（ 3）二价离子 Mg2+被 Mn2+、 Cu2+Zn2+Ca2+取代；（ 4） Mg2+浓度低于 25mmol/L （ 5） Buffer pH 不能高于 8；（ 6）有机溶剂的干扰。 30. DNA 分子体外连接条件 （ 1）一条 DNA 链 3’端存在游离的 3’OH （ 2）一条 DNA 链 5’端存在游离的 5’磷酸基团 （ 3）连接体系需要能量 ATP 31. 碱性磷酸酶的类型： a 细菌碱性磷酸酶（ BAP） b 小牛肠碱性磷酸酶（ CIP） 32. 平末端 DNA 片段连接的方法 （ 1） T4 DNA 连接酶连接法 （ 2）同聚物 加尾 法 （ 3）限制片段末端修饰法 （ 4）衔接物连接法 （ 5） DNA 接头连接法 33. T 载体结构上有哪些优点。 （ 1） T 载体是一种线性双链 DNA，不需切割，即可扩增 PCR 产物； （ 2） 3’–T 单核苷酸延伸末端，可 直接 与 PCR 产物具有 3’ –A 单核苷酸延伸的分子进行 碱基 互补； （ 3）线性载体已经脱去 5’ –P， 自己 不会再环化； （ 4） T 载体中设计了 Lac Z 基因，可通过显色反应 X–gal 显色反应分离重组体 ； （ 5）在 T 载体的 3’末端附近还设计了多个核苷酸酶切位点 ，便于进行多种亚克隆 ； （ 6） T 载体含有 T7， SP6 两种启动子，便于测序。 34. 理想的质粒载体应具备 的条件 （载体的结构特点） ： （ 1）必须具备复制起点； （ 2）具有抗生素抗性基因； （ 3）具有若干核酸内切限制酶的酶切位点； （ 4）具有较小的分子量，较高的拷贝数。 35. λ 噬菌体基因组结构 （ 1）左侧区，自基因 A 到基因 J，包括参与噬菌体头部蛋白质和尾部蛋白质合成所需要的全部基因； （ 2）中央区，介于基因 J 与基因 N 之间，非必要区，编码的基因与保持噬菌斑形成能力无关，但 包含了一些与重组有关的基因，以及使噬菌体整合到大肠杆菌染色体中去 的 int 基因，和把原噬 菌体从寄主染色体上删除下来的 xis 基因； （ 3）右侧 区，位于 N 基因的右侧，包括全部主要的调控基因，复制基因，溶菌基因。 36. λ噬菌体载体的主要类型 取代型，插入型 37. λ ZAP 的结构特点 λ ZAP 是一种典型的插入型 λ 噬菌体载体，可将插入的 DNA 片段直接从 λ 载体转移到质粒载体。 其结构特点： （ 1）其两侧是由两个单链 DNA 噬菌体 f1 的复制信号，即 f1 起始子和 f1 终止子包围着； （ 2）含有一个可以在体内发生删除作用的 pBluescript 噬菌粒的 DNA 片段； （ 3）在 pBluescript 噬菌粒两端有 T3 和 T7 噬菌体启动子的多克隆位点区，可制备 RNA 探针。 38. λ ZAP 的优点 （ 1）具有多种核酸内切限制酶的。