农业科学技术成果研究报告

农业科学技术成果研究报告内容摘要：

发酵技术，生产复合微生物制剂 生物肥药。 建立以利用农业防治、生物肥药等综合防控技术及枯萎病综合治理标准操作规程。 建立了以利用农业防治、生物 10 肥药等综合防控技术进行茄科与瓜类蔬菜主要土传病害的生物防治，累计推广 20 多万亩次，对不同茄科与瓜类蔬菜主要土传病害防效达 7590%，累计增收 8000 万元。 鉴定专家组一致认为，本项目总体上达到国际领先水平。 4）获农药登记证 5 项，获得研究成果 4 项，申请国家专利 15 项，其中授权 9 项，出版著作 2 本，发表论文 112 篇，完成研究报告 500 多篇，培 养博士 2 名，研究生 20 名。 11 4．创新点及创新程度： （ 1）青枯生防菌 ANTI8098A 的筛选和培养 采用目标病原菌多重菌株平行测定法从我省福州、莆田、三明、龙岩、宁德、南平、厦门、漳州、泉洲茄科作物根系土壤中分离的微生物菌种中，筛选出 对 青枯生防菌 ANTI8098 菌株（ Bacillus cereus ANTI8098），对青枯病原菌有良好的抑制作用，经德国微生物菌种保存定名为 ANTI8098A，并进行了该菌的微生物学研究和培养基配方的筛选，使发酵水平达到每毫升 40 亿芽孢以上，为工业化生产打下了基础。 （ 2）青枯生防菌致弱机理的提出 抑菌机理可以分为：拮抗、抗生、诱导、竞争等几种，本研究首次发现了青枯病生防菌的致弱现象，即生防菌 ANTI8098A 使用后，使得青枯菌的强致病力菌株转化为无致病力菌株，使青枯病的发生受到抑制。 并通过病理学、微生态学、分子生物学等方法，对生防菌的致弱机理进行了研究，提出了 PCR 电泳、紫外分光、液相色谱、异源吸附蛋白、 TTC 培养基测定、寄主植物回接、增长率测定 等一套致弱作用的检测方法。 本研究提出一种科学假说，抑菌机理的致弱原理，即由微生物产生的中间产物的作用，使强致病力菌株的菌株转化为无致病力菌株的菌株，使无致病力菌株发展成为微生物环境的优势菌体，达到抑制病害的作用。 经国内外文献检索未见生防菌对青枯病原菌致弱作用的报道，致弱原理的提出，补充了抑菌机理，建立了新的抑菌机理的原理和方法，为青枯病生物防治机理的研究提供了新思路。 同时对于病害弱株系的应用，可能找到了一条新途径。 （ 3）青枯生防菌 ANTI8098A 抑菌物质的分离 通过对生防菌 ANTI8098A 发酵液进行离心、蛋白质分析、分子筛分离，耐热反应，发现生防菌 ANTI8098A 的抑菌物质是一种非蛋白质的耐热毒素，不同分子量的 ANTI8098的发酵产物对青枯病原菌有不同的抑制作用。 生防菌在小分子量范围（ 1000 道尔顿）聚集了多糖类耐热抗菌物质，在大分子量范围（ 20200 道尔顿）聚集了蛋白质类的抗菌物质的增效因子。 （ 4）青枯生防菌 ANTI8098A 的发酵技术 生防菌 ANTI8098A 生产是利用生物反应器进行发酵。 最初的细菌发酵的靠人工控制，进而使用仪表控制，发展到用计算机控制。 本研究提出了 网络监控生物反应器的研究，并自行设计了生物反应器计算机控制软件和硬件，网络监控软件，实现了生物反应器的网络监远程控技术。 网络监控生物反应器实体模型由生物反应器、传感器和执行机构、计算机控制系统、网络远程监控技术组成。 整个系统将现场发酵的条件和图象上网，实现生物反应器运行过程的远程网络控制。 经国内外文献检索未见网络远程实时监控技术在青枯菌生防菌发酵过程应用的报道。 本研究对生防菌 ANTI8098A 发酵过程培养基上罐实消的参数变化进行了研究，提出一套实消过程的参数模型，为网络控制生物反应器的设计提供模拟参数。 12 （ 5）青枯生防菌 ANTI8098 的制剂技术 在研制防治青枯病的微生物农药时，存在的主要问题是微生物农药中菌的保存和使用时菌在土壤中的定殖问题。 作为生物农药，要求菌的保存期应达 24 个月以上，制剂中的菌存活力的控制十分关键。 由于土壤本身具有天然的生物缓冲作用，青枯生防菌施用于土壤时，菌体大量死亡或菌量迅速减少，土壤微生物菌系的竞争无法定殖，这是生防菌防治效果不稳定的重要原因之一。 为了提高生防菌在制剂中的存活率，减缓在土壤中的死亡率，提高在土壤中定殖水平，本试验对生防菌 ANTI8098A 的存活基质进行 了研究，筛选所得的存活基质（ Survival Material），提高了生防菌在基质保存中的存活率，延缓了其在土壤中的衰亡时间，将筛选出的优良基质通过混合、干燥、制粒、包装，即成为生物杀菌剂（商品名：安地 ANIT），多年的试验表明茄科青枯病具有良好的防效。 （ 6）青枯生防菌剂 ANTI8098A 的生物测定技术 青枯菌的生物防治，受到环境因素影响很大，如温湿的影响作用可以超过生防菌本身的防治效果，如果没有一致的无病虫苗、稳定的温湿度控制、良好的光照条件，生防菌的生物测定是难以进行。 本研究设计的水层隔热 式控湿网室由铝合金结构、顶部水槽、防虫网、控湿系统、双层隔离门组成，为寄主植物苗的培育提供良好的光照、通风、隔热、湿度、严格的害虫隔离条件，解决用于生防菌生物测定的无病虫植物苗的培育。 光波温室由控温系统、控湿系统、滴灌系统、光波调节系统组成，为生防菌生物测定过程提供标准稳定的植物正常生长的环境，提高生物测定的精 度。 视频监视人工气候箱由箱体，光照系统、温度系统、湿度系统、视频监控系统组成，为进行温度对生防菌防治青枯病的影响提供条件。 同时实现远程监视和自动记录。 三个设备的设计，为生防菌生物测定提供稳定的环境条件，提高生物测定的精确度。 （ 7）青枯生防菌剂 ANTI8098A 的毒性 项目组已完成了生防菌剂 ANTI8098A（安地）农业部规定毒性检测，包括 1）大鼠急性经口毒性试验， 2）大鼠急性经皮毒性试验， 3）大鼠急性吸入毒性试验， 4）家兔急性皮肤刺激试验， 5）家兔眼刺激试验， 6）豚鼠皮肤变态反应（致敏）试验。 检测结果表明，生防菌剂 ANTI8098A（安地）属微毒性农药，对皮肤和眼无任何刺激作用。 （ 8）采用营养亲和群、脂肪酸等方法系统分析了不同茄科与瓜类寄主来源的尖孢镰刀菌种下分化特征，建立了尖孢镰刀菌寄主专化型脂肪酸判别模型 通过 茄科与瓜类蔬菜 枯萎病害调查，首次分析了枯萎病的空间蔓延规律，并利用常规诊断及分子诊断相结合方法进行了病原菌的复合侵染研究。 首次采用营养亲和群和脂肪酸等方法系统分析了不同茄科与瓜类寄主来源的尖孢镰刀菌种下分化特征，首次建立了尖孢镰刀菌寄主专化型脂肪酸判别模型。 （ 9）尖孢镰刀菌无毒基 因的克隆及测序 对来源于黄瓜、甜瓜、西瓜、辣椒、茄子、花生、和豇豆等寄主的 90 个尖孢镰刀菌菌株，利用引物 ORF1/ORF2 进行 PCR 扩增目的基因 SIX1 的片段，经测序及 BLAST 比 13 对共获得 30 条有效序列。 采用番茄镰刀枯萎病菌 SIX1 无毒基因引物 P12F2/P12R1PCR扩增序列，通过克隆测序，验证了菌株 FJAT9290 携带无毒基因（ GenBank 登录号AJ608702），该基因为目前国内第一个从尖孢镰刀菌上获得的无毒基因。 （ 10）筛选了多株茄科与瓜类枯萎病生防菌，包括短短芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌、哈 茨木霉、凝结芽胞杆菌，研究其微生物学特性及其（复合）微生物发酵技术，生产复合微生物制剂 生物肥药 筛选出具有自主知识产权的、生防效果稳定的枯萎病生防细菌芽胞杆菌（短短芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌和凝结芽胞杆菌）和生防真菌哈茨木霉菌，研究其微生物学特性及其（复合）微生物发酵技术，生产复合微生物制剂 生物肥药。 申报专利 8 项，其中授权 4 项，获得农药登记证 2 项。 （ 11）将淡紫拟青霉应用于甘薯茎线虫的防治，建立了高毒力培养数学模型 对淡紫拟青霉的研究主要用于控制根结线虫和胞囊线虫。 本项目筛选出对多种作物根结线虫（ Meloidogyne spp）高防效的淡紫拟青霉 NHPL2020 菌株，首次发现了该菌株对甘薯茎线虫（ Ditylenchus destrutor）具有很高的毒杀效应，明确了培养基营养、培养温度、 pH 和通气量对淡紫拟青霉 NHPL2020 杀线毒力的影响，建立了高毒力淡紫拟青霉NHPL2020 培养数学模型。 田间试验效果表明，淡紫拟青霉 NHPL2020 菌剂防治甘薯茎线虫效果显著，持效期长，与常规化学农药比较，价格低，效果好，无药害，无残留，有良好的经济、生态、社会效益。 （ 12）明确淡紫拟青霉 NHPL2020 的杀线机理，对其几丁质酶基因进行了克隆 已有研究证明淡紫拟青霉分泌的几丁质酶对根结线虫的卵有活性，但该菌的几丁质酶基因未见报道。 本项目深入地研究了淡紫拟青霉 NHPL2020 的杀线机理，明确了菌株分泌几丁质酶是作物线虫毒杀活性因子，首次克隆了淡紫拟青霉 NHPL2020 的几丁质酶基因，命名为 PLChi1，通过转录表达证实该基因功能是消解作物线虫体表和卵壳的几丁质层主要因子。 （ 13）明确淡紫拟青霉 NHPL2020 对枯萎病菌的抑菌机理，获得了其活性成分 国内外已有淡紫拟青霉抑制枯萎病的报道，但未 确定其抑菌成分。 本项目证实淡紫拟青霉 NHPL2020 对枯萎病病原菌 尖孢镰刀菌有着强烈的抑菌作用，明确了其抑菌机理是菌株产生 β葡萄糖苷酶消解病原菌细胞壁，产生多糖抑制尖孢镰刀菌的生长繁殖。 首次完成了淡紫拟青霉 NHPL2020 多糖分子结构的分析，证实了该菌株多糖为单链无分支的 β(13)D葡聚糖。 优化了淡紫拟青霉 NHPL2020 产生 β葡萄糖苷酶和多糖的培养条件，提高了该菌株对尖孢镰刀菌的抑菌能力。 （ 14）证实了淡紫拟青霉 NHPL2020 对有机磷农药的降解效应，明确其降解机制 现有研 究发现淡紫拟毒霉能促进难溶磷酸盐的溶解，同类研究还表明，拟青霉还能促进许多化学聚合物（如农药，制革废水等）的分解。 本项目首次发现淡紫拟青霉NHPL2020 对辛硫磷农药有显著的降解效应，在防治作物线虫和枯萎病的同时可以降解 14 农药残留，明确其机制包括两个方面：一是淡紫拟青霉菌体释放的降解酶对有机磷的分解；二是淡紫拟青霉菌丝球对有机磷的吸附作用，并优化了淡紫拟青霉最佳有机磷降解效能的发酵条件。 （ 15）创新生产工艺，研发具有自主知识产权的淡紫拟青霉制剂 本项目突破了真菌深层发酵的技术难点，设计出 “一步发酵法 ”， 优化培养基、发酵条件以及流加技术，创新菌体包被工艺，建立了生产技术操作规程和质量标准，申请国家发明专利 2 项，研发出淡紫拟青霉母药，获得农业部农药登记证号 PD20206840，成为全国为数不多的淡紫拟青霉母药生产单位，并以该菌剂母粉为基础，开发出含 2 亿活孢子 /克淡紫拟青霉粉剂，获得农业部农药登记证。