生物技术概论ppt课件讲义

生物技术概论ppt课件讲义内容摘要：

构如下所示： pUC系列质粒载体具有三个显著特点： （ 1）分子量更小，仅为 ，容纳外源 DNA量增大；具有更高的拷贝数（不用氯霉素扩增，每个细胞含 500700个拷贝）。 （ 2）含易于检测是否有外源 DNA插入的标记基因 LacZα，可利用 互补原理进行蓝白筛选。 （ 3）多克隆位点区（ MCS）：由人工合成的多个单一酶切位点构成。 每一种限制性内切酶会产生不同的粘性末端，可选用两种内切酶组合在质粒载体和外源 DNA上产生相同的末端，进行双粘端连接，既提高克隆的效率，又可以定向克隆。 其 MCS区与 M13mp噬菌体载体的相同，可使 pUC上克隆的目的基因直接转移到 M13mp载体，进行 DNA测序和体外突变等研究。 农杆菌 Ti质粒载体 （ 1）根癌农杆菌：根癌农杆菌可在许多双子叶植物中导致冠瘿病的形成。 冠瘿瘤的形成是E c o S ac K p n S m a B am X b a S al P s t S p h H i nRI I I I H I I I I I d I I IpU C 1 8pU C 1 9H i n S p h P s t S al Xb a B am S m a K p n S ac E c od I I I I I I I H I I I I RIApO r iL a c Z( 8kb )r 25 由于 Ti(tumor inducing) 质粒导致的。 侵染后，一部分分子将整合到植物的染色体 DNA中，这一片段称为 TDNA，大约有 15kb30 kb（编码产物可使植物产生冠瘿瘤）。 TDNA只要保留两端的边界序列，即使中间的序列被任何外 源的基因所替代，仍可整合到植物基因组中。 （ 2）作用：利用 Ti质粒将新的基因引入植物。 可以将基因插入 TDNA中，细菌就可以将它整合到植物的染色体 DNA中。 （ 3）图示利用 Ti质粒载体将外源基因引入植物细胞中的过程： 酵母 2μm质粒载体 几乎所有的酿酒酵母菌中都存在一种质粒，即 2μm质粒。 人们利用 2μm质粒构建了一系列克隆载体。 他们一般为穿梭质粒载体，既含有 2μm质粒的复制起始位点（可在真核细胞中复制），又含有大肠杆菌源质粒的复制起始位点（可在原核细胞中复制）。 λ 噬菌体克隆载体 （ 1） λ 噬菌体的组成 ： 一种温和的诱导性噬菌体，其基因组除在 539。 端有 12个可互补的碱基外均为线性双链DNA，感染时 DNA形成环状。 是 一种感染大肠杆菌的病毒。 1951年 J. Lederberg的妻子 Esther Lederberg证明了 J. Lederberg和 Tatum用来杂交的 K12中有原 噬菌体 ，并命名为 λ，经 10年的研究搞清了溶原化的实质。 λ噬菌体的基因组长达 50Kb， 共 61个基 因，其中 38个较为重要。 26 （ 2） λ 噬菌体构建克隆载体的依据 ： 构建 λ 噬菌体载体的基本原理是多余限制位点的删除。 按照这一基本原理构建的 λ 噬菌体的派生载体，可以归纳成两种不同的类型：一种是插入型载体（ insertion vectors），只具有一个可供外源 DNA 插入的克隆位点。 另一种是替换型载体（ replacement vectors），具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的人 DNA 区段可以被外源插入的 DNA 片段所取代。 在基因克隆中的二者的用途不尽相同。 插入型载体只能承受较小分子量（一般在 10kb 以内）的外源 DNA 片段的插入，广泛应用于 cDNA 及小片段 DNA 的克隆。 而替换型载体则可承受较大分子量的外源 DNA 片段的插入，所以适用于克隆高等真核生物的染色体 DNA。 （ 3）构建 λ 噬菌体克隆载体的策略 ： A. 插入型载体 外源的 DNA 克隆到插入型的 λ 载体分子上，会使噬菌体的某种生物功能丧失效力，即所谓的插入失活效应。 插入型的 λ 载体又可以分为免疫功能失活的（ inactivatiort of immunityfunction）和大肠杆菌 β半乳糖苷酶失活的（ inactlvatlon of E． coli βgalactosidase）两种亚型。 ① 免疫功能失活的插入型载体：在这类插入型载体的基因组中有一段免疫区，其中带有一两种核酸内切限制酶的单切割位点。 当外源 DNA 片段插入到这种位点上时，就会使载体所具有的合成活性阻遏物的功能遭受破坏，而不能进入溶源周期。 因此，凡带有外源DNA 插入的 λ 重组体都只能形成清晰的噬菌斑，而没有外源 DNA 插入的亲本噬菌体就会形成混浊的噬菌斑。 ② β半乳糖苷酶失活的插入型载体：它们的基因组中含有一个大肠杆菌的 lac5 区段，其中编码着 β半乳糖着酶基因 lac Z。 由这种载体感染的大肠杆菌 lac指示菌，涂布在补加有 IPTG 和 Xgal 的培养基平板上，会形成蓝色的噬菌斑。 如果外源 DNA 插入到 lac5 区段上，阻断了 β半乳糖着酶基因 lacZ 的编码序列，不能合成 β半乳糖昔酶，只能形成无色的噬菌斑。 B. 替换型载体 替换型载体又叫做取代型载体（ substitution vector），是一类在 λ 噬菌体基础上改建的、在其中央部分有一个可以被外源插入的 DNA 分子所取代的 DNA 片段的克隆载体。 λ NM781 便是其中的一个代表。 在这个替换型载体中，可取代的 EcoR I 片段，编码有一个 supE 基因（大肠杆菌突变体 tRNA 基因） ,由于这种 λ NM781 噬菌体的感染，寄主细胞lacZ 基因的琥珀突变更被抑制了，能在乳糖麦康基氏（ MacConkey）琼脂培养基上产生出红色的噬菌斑，或是在 Xgal 琼脂培养基上产生出蓝色的噬菌斑。 如果这个具有 supE 基因的 27 EcoRI 片段被外源 DNA 取代了，那么所形成的重组体噬菌体，在上述这两种指示培养基上都只能产生出无色的噬菌斑。 用替换型载体克隆外源 DNA 包括三个步骤： 第一，应用适当的核酸内切限制酶消化 λ 载体，除去基因组中可取代的 DNA 区段。 第二，将上述 所得的人 DNA 臂同外源 DNA 片段连接。 第三，对重组体的 λ DN A 分子进行包装和增殖，以得到有感染性的 λ 重组噬菌体。 (4) λ 重组体 DNA 分子的体外包装 ： A. λ 重组体 DNA 分子的转染作用。 用 λ 重组体 DNA 分子直接感染大肠杆菌，使之侵入寄主细胞内。 这种由寄主细胞捕获裸露的噬菌体 DNA 的过程叫做转染（ transfection），它有别于以噬菌体颗粒为媒介的转导（ kransduction）。 λDNA的转染作用，是一种低效的过程。 即便是使用未经任何基因操作处理的新鲜制备的 λ DNA，其典型的转染效率（ 即每微克 λDNA转染产生的噬菌斑数目），也仅为 105～ 106 之间。 体外连接的结果，转染效率便下降到 104～ 103 左右。 B. λ DNA 的体外包装。 λ DNA 的体外包装作用，在离体条件下，将重组体 DNA 包入噬菌体等病毒颗粒中的过程，以形成有功能的病毒载体。 根据体外互补作用研究发现， λ 噬菌体的头部和尾部的装配是分开进行的。 头部基因发生了突变的噬菌体只能形成尾部，而尾部基因发生了突变的噬菌体则只能形成头部。 将这两种不同突变型的噬菌体的提取物混合起来，便能够在体外装配成有生物活性的噬菌体颗粒。 这就是噬菌体体外包 装所依据的基本原理。 C. λ 噬菌体 DNA 的包装限制问题。 λ 噬菌体头部外壳蛋白质容纳 DNA 的能力是有一定限度的。 上限不得超过其正常野生型 DNA 总量的 5％左右，而低限又不得少于正常野生型 DNA 总量的 75％。 按野生型 λ DNA分子长度为 48kb 计算， λ 噬菌体的包装上限是 51kb。 编码必要基因的 DNA 区段占 28kb，因此 λ 载体克隆外源 DNA 的理论极限值应是 23kb。 植物病毒 克隆载体 （ 1） 植物病毒 克隆载体种类： 用于构建植物病毒克隆载体的病毒种类很多，如：花椰菜花叶病毒（ CaMV）、烟草花叶病毒（ TMV） 等。 （ 2）构建 植物病毒 克隆载体的克隆策略： 制备克隆载体时要经过改造，消除其对植物的致病性，保持其转染或转导植物细胞的 28 能力。 动物病毒 克隆载体 （ 1）动物病毒 克隆载体的 利用： 用于构建动物病毒克隆载体的病毒如：痘苗病毒、腺病毒、猿猴空泡病毒、反转录病毒等。 （ 2）典型的 动物病毒 克隆载体：痘苗病毒克隆载体。 痘苗病毒是两端具有倒置重复序列的线型双链 DNA分子，编码 200多种蛋白。 构建痘苗病毒克隆载体一般采用同源重组的方法：将外源基因两端连接上痘苗病毒 DNA上具有的基因，如 TK（胸苷激酶）基因及 HA（血凝素 ）基因，通过同源重组，将外源目的基因整合到痘苗病毒基因组上。 痘苗病毒近年来被广泛的用于表达各种外源基因（如：用于表达人血小板生成素）、用于基因治疗及制备基因工程疫苗（如：狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、乙肝疫苗）。 人工染色体载体 （ 1）人工染色体载体的定义： 人工染色体 （ artificial chromosome） 指人工构建的含有天然染色体基本功能单位的载体系统。 包括酵母人工染色体（ YAC）、细菌人工染色体（ BAC）、 P1派生人工染色体（ PAC）、哺乳动物人工染色体（ MAC）和人类游离人工染色体（ HAEC）。 人工染色体为基因组图谱制作、基因分离以及基因组序列分析提供了有用的工具。 利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的 载体 称为 人工染色体载体 (artificial chromosome vectors)，其装载外源 DNA片段的容量可以与染色体的大小媲美。 （ 2）特点：能容纳长达 1000Kb3000Kb的外源 DNA片断，主要用于构建基因组文库，也可用于基因治疗和基因功能的鉴定。 如：酵母人工染色体 (YAC)载体主要用于构建真核生物基因组 DNA文库，因为真核生物许多基因过于庞大而不能作为单一片断克隆于以上提到的 载体之中，例如，人凝血因子Ⅷ基因长 180kb，肌营养不良基因至少长 1800kb。 （ 3）人工染色体载体按结构分为线性和环形： 线形人工染色体载体：必须含有端粒、着丝点、复制起始区。 如：酵母人工染色体（ YAC）、人类人工染色体（ HAC）、哺乳动物人工染色体（ MAC）。 环形人工染色体载体：不需端粒及着丝粒，但要有复制起始区。 如：细菌人工染色体（ BAC）。 29 第 四 节 DNA重组 一、重组 DNA技术的定义 重组 DNA技术又称为基因克隆或分子克隆技术， 包括了一系列的分子生物学操作步骤。 重组 DNA技术的重大突破带动 了现代生物技术的兴起，并很快产生了许多生命科学的高技术产业。 它是基因工程的核心技术， 所谓基因工程 (geic engineering)就是把外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制，转录，翻译表达的操作叫基因工程。 基因工程可使另一种生物获得新的遗传性状或表达所需要的产物。 二、重组 DNA操作 的 一般步骤 （ 1）获得目的基因； （ 2）与克隆载体连接，形成新的重组 DNA分子； （ 3）用重组 DNA分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传； （ 4）对转化子筛选和鉴定； （ 5）对获 得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。 如下图： 30 三、 DNA重组的具体过程 目的基因的获得：前面已经详细介绍。 载体的制备：前面已经详细介绍。 目的基因与载体的连接： （ 1） DNA连接酶：能催化双链 DNA片段紧靠在一起的 3‟OH末端与 5‟P末端之间 形成磷酸二酯键，使两末端连接的酶。 例如， T4 DNA连接酶既可催化具互补黏性末端 DNA片断之间的连接，也可催化具平末端 DNA片断之间的连接（效率比较低）。 （ 2） DNA片段之间 的连接： A. 互补黏性末端片段之间的连接相同的酶产生的黏性末端：连接后仍保持原识别序列。 B. 平末端片段之间的连接：需 T4 DNA连接酶进行连接。 C. 平末端片段末端修饰后连接：不同的限制性核酸内切酶酶切后，产生的末端如果不是互补黏性末端。 外切核酸酶Ⅶ修饰成平末端然后再进行连接。 末端脱氧核苷酸转移酶（简称末端转移酶）将末端修饰成互补黏性末端再进行连接。 图示四种核酸内切酶的酶切序列以及作用位点： 31 （ 3） 目的基因与载体的连接的示意图： A. 片段之间的连接： ： 32 （ 4）连接过程涉及的 DNA连接酶的使用方法：以 T4 DNA连接酶为例。 目的基因的片段：。