细菌基因工程

细菌基因工程内容摘要：

基因种类，主要存在于库斯塔克亚种 (subsp. kurstaki)中，其作用对象也是农业经济中最重要的一类害虫，如危害蔬菜、棉花、玉米、水稻、烟草以及森林等的鳞翅目昆虫。 cry3Aa 杀虫晶体蛋白基因主要来自 Bt 拟步行甲亚种 (subsp. tenebrionis)，它对鞘翅目昆虫如马铃薯甲虫有特异性毒力，目前开发的防治鞘翅目昆虫的 苏云金芽孢杆菌 杀虫剂主要由该亚种制备。 通过基因工程技术改造 Bt 主 要是为了增强杀虫毒力、拓宽杀虫范围、延长持效期、克服可能出现的昆虫抗性等。 （ 1）增强杀虫毒力 通过提高某个高毒力杀虫基因的表达量在一定程度上可增强杀虫活性。 例如将 cry1Ac 杀虫基因导入高毒力生产菌株（一般都是库斯塔克亚种），可增加其杀虫活性。 为了提高目标基因的表达量，可利用帮助蛋白基因使表达的晶体蛋白更易形成伴胞晶体而提高表达量 ，或通过更换 cry3Aa 杀虫晶体蛋白基因 的启动子来克服 因子的竞争而提高表达量。 我国通过这种方法构建的高毒力 Bt 菌株已通过农业基因工程安全审批完成了商品化生产试验。 通过导入活力提高的杀虫基因或杂合基因（ 如 cry1Ab 与 cry1C 基因的嵌合基因 ）也可提高杀虫活性。 （ 2）拓宽杀虫范围 Bt 的杀虫基因的活性范围各不相同，不同的菌株所含的杀虫基因的种类和数量也不同，因此不同菌株的杀虫活性和杀虫范围各不相同。 高毒力生产菌株一般对甜菜夜蛾和鞘翅目昆虫低毒或无毒，将 cry1C 基因或 cry3Aa 基因导入库斯塔克亚 种中可扩大其杀虫谱。 相关的基因工程菌株已有部分进入“环境释放”试验。 （ 3）延长持效期 为了延长持效期，有人将芽孢形成较后阶段的基因突变，使杀虫基因正常表达，但芽孢不能完全成熟，细胞外壳相当于一层生物囊可保护伴胞晶体不受紫外线（ UV）等自然条件的不利影响。 （ 4）克服可能出现的昆虫抗性 来自以色列亚种的 cyt1A 基因具有克服昆虫抗性的能力，人们已经将该基因导入库斯塔克亚种中以期延长可能出现的昆虫抗性问题。 苏云金芽孢杆菌 表达系统 的构建 涉及 以下 方面 ： 首先确定 载体的类型 , 主要是质粒载体，同时为了复 制的稳定，一般用 Bt自身质粒的复制区作为载体的复制单元 ，如前面所述的穿梭载体 pHT304。 但是，为了最大限度地保证基因工程菌环境释放的安全性，要求将载体中的非 Bt来源的 DNA片段去掉，如抗生素抗性基因以及来自大肠杆菌的 DNA片段。 为 此 ，采用了 Bt转座子中的位点特异性重组系统，在引入携带重组酶基因的辅助质粒的帮助下，质粒载体内部发生重组，形成两个质粒，其中携带抗生素抗性基因和大肠杆菌基因片段的质粒由于不能复制而丢失 ，保留来自 Bt的 DNA片段。 这种载体称为 解离载体 ，其工作过程见图 165。 345 图 165 苏云金芽孢杆菌解离载体的工作原理 erm： 红霉素抗性基因 ； amp： 氨苄霉素抗性基因 ； ： 大肠杆菌克隆载体复制起点 ； Res:Bt转座子 Tn4430的重组位点 (解离位点 )；cry1Ac10:杀虫晶体蛋白基因； ori1030:来自 Bt内源质粒的复制区。 当重组质粒 pBMB801进入 Bt菌后，再通过温度敏感复制的辅助质粒将解离酶基因 tnpI导入重组菌，由此导致两个 res位点之间发生重组，从而形成两个质粒。 其中 pBMB801B只含有来自 Bt的 DNA片段 且含有质粒复制区，能够在 Bt中稳定复制，就像 Bt的内源质粒一样； pBMB801E不含在 Bt中的复制单元，随着菌体的复制而逐渐消失。 农用抗生素产生菌的遗传操作 农用抗生素是由抗生菌发酵所产生的具有农药功能的次生代谢物质，它是有明确分子结构的化学物质，如 阿维菌素（ Avermectin） 、 链霉素 (Streptomycin)和 日光霉素 (Nikkomycin)等，具有杀虫、杀螨、杀线虫或杀真菌活性。 阿维菌素是目前世界上有关生物合成基因簇研究 得 最为深入的抗生素之一， 产生阿维菌素的 阿维链霉菌（ Streptomyces avermitilis） 的全基因组测序已经完成， 在利用基因工程进行抗生素的人工改造方面已有了许多成功的范例。 我国通过缺失其生物合成途径中的 C50甲基转移酶而阻断支路代谢，获得了仅产 B 组分的工程菌，这种微生物农药更加高效和低毒，还大通过辅助质粒导入 tnpI 基因 346 大简化工艺流程和降低生产成本。 由于 目前有关链霉菌的基因簇克隆和遗传操作技术平台已经建立并日趋完善，随着 现代分子生物学和生物信息学技术的迅速发展，特别是聚酮生物合成调控的分子机理的阐明，人们 已经 能 够 有的放矢地利用抗生素基因簇资源，提高农用抗生素产量与品种。 杀虫抗病重组 微生物 许多细菌具有杀死或抑制植物病原菌的作用，或具有促进植物生长的作用，或在植物的叶面或根部具有优势定殖能力，将杀虫基因导入这些细菌，可以获得改良的杀虫细菌。 例如 荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)对作物病原菌具有抑菌活性 (如对小麦全蚀病菌 )以及较强的根部定殖能力，以这类假单胞菌为受体构建的工程菌，能表现出良好的防虫抗病活性。 有些 枯草芽孢杆菌能稳定地在土壤和植物表面定殖 ， 产生抗生素 ， 分泌刺激植物生长的激素 ， 并能诱导寄主产生抗病性，是一种理想的微生物杀菌剂，有广阔的应用前景。 将 Bt杀蚊 晶体蛋白 基因或 cry1A杀虫晶体蛋白 基因转入枯草芽孢杆菌，成功获得杀蚊和杀虫并 能 抗水稻纹枯病的重组菌。 4．其它重组杀虫抗病微生物 微生物种类繁多，生物性状丰富，构建出的杀虫抗病重组菌也非常多。 以下简要举例。 （ 1）生物囊杀虫剂 将 Bt毒素蛋白基因转入萤光假单胞菌中， 使其高效表达并形成伴胞晶体，发酵后通过物理和化学方法将菌体杀死但不破坏伴胞晶体而且菌体外形保持完整，从而形成一种生物囊制剂（图 166），这种制剂在田间应用时其有效期平均增加了两百多倍， 对小菜蛾的杀虫效果与化学农药相当，无污染环境的副 作用，成为一种新型的微生物杀虫剂，用于蔬菜害虫防治。 图 166 萤光假单胞菌 合成苏云金芽孢杆菌的 伴胞晶体 ， 用于开发生物囊杀虫剂 (Gaertner et al., 1993) （ 2）基因工程抗病菌 放射农杆菌 (Agrobacterium radiobacter) K84可产生 农杆菌素 (agrocin) 84, 其组分为腺嘌呤脱氧阿拉伯糖苷氨基磷酸盐，可有效地防治根癌农杆菌 (A. tumefaciens)引起的桃、樱桃、葡萄、玫瑰等植物的根癌病。 但在该菌的质粒 pAgK84上含有抗该核苷酸杆菌素的 抗性基因，在应用过程中该质粒会通过接合转移转到病原菌中，从而使病原菌获得抗性，防病效果大大降低。 将该质粒上接合转移必需的 tra基因删掉后构建的重组菌可克服这一问题，并开发成第一个商品化的重组微生物杀菌剂 Nogall，该制剂已在澳大利亚、美国、加拿大等 9个国家推广应用。 （ 3） 杀虫抗病工程菌 将具有抑制欧文氏菌病原基因表达的 aii基因（ AHL内酯酶）通过 S 347 层蛋白为载体在 Bt细胞表面表达，构建出杀虫抗病工程菌，在魔芋田间试验中表现出对软腐病菌的良好抗病效果。 转基因杀虫抗病作物的推广，无疑对微生物农药 的发展形成挑战，但微生物农药具有可靠 的安全性、防治的有效性、防治对象的多样性及生产 方式 的灵活性，难以被取代。 可以期待微生物防治在低残毒、难以产生抗药性的优点的基础上，借助基因工程的方法能合成或创造出更多新的产物以提高生物农药的稳定性及作用效率，微生物农药 依 然有着良好的发展前景。 （ 二 ） 微生物肥料 利用微生物的生命活动及代谢产物的作用，改善作物养分供应，为农作物提供营养元素、生长物质、调控生长、增强抗逆性，达到提高产量、改善品质、减少化肥使用、提高土壤肥力 的 一类生物制品就是微生物肥料。 这类制品都有一个共同的 特点，即含有一定量的特定功能的微生物，而且这些活体微生物起着重要作用。 微生物肥料的使用可减少化肥用量、减少能源资源消耗。 微生物肥料主要有以下种类：①固氮菌，主要利用自身的固氮能力，将大气中的氮气转变为植物可以吸收利用的铵盐等氮源。 固氮菌可分为自生固氮菌、共生固氮菌和联合固氮菌三类，其中与豆科植物共生的根瘤菌固氮效果最佳，因而使用也最为广泛。 根瘤菌肥料是世界各国应用最多的微生物肥料。 ②解磷菌，主要利用 巨大芽孢杆菌 (Bacillus megaterium)，把土壤中不溶性磷转变为植物可吸收利用的可溶性磷酸盐。 ③解钾菌，主要是 胶质芽孢杆菌（ Bacillus mucilaginosus,又名硅酸盐细菌），可把钾元素从不溶性含钾矿石中释放出来，供植物吸收利用。 ④植物根际促生菌或 植物根圈促生细菌 (PGPR)， 又叫 ―增产菌 ‖或 ―多效菌剂 ‖，这是一类能在植物根部大量定殖的有益菌群，它们可抑制植物病原菌生长。 ⑤ VA菌根真菌，它是一类与植物根系共生的真菌，帮助植物吸收多种矿质营养成分，特别是磷素营养。 ⑥腐熟剂，主要是加速高分子有机物分解为小分子养分物的腐生菌。 ⑦光合细菌，如红螺菌等，它们能够为作物提供部分碳源和一些有益的代谢物。 ⑧复合菌肥，即将以上菌肥的两种或多种混合施用，产生比单独施用更好的效果。 目前，应用最广、影响最大的微生物肥料为基因工程固氮菌。 对根瘤菌进行的基因工程研究集中在进一步提高固氮效率和解决 “ 老区问题”。 “老区问题 ” 指的是根瘤菌剂接种在从未种植过相应豆科植物的“新区”时增产效果显著，而在多年种植的“老区”效果不稳定。 其主要原因是在“老区”接种根瘤菌常面临土著根瘤菌的竞争而降低了占瘤率和共生固氮效率。 解决“老区问题 ” 的方法主要有使接种菌产生能够抑制土著菌的抗菌素以及导入竞争结瘤相关基因增加菌剂的结瘤能力等。 提高根 瘤菌固氮能力的途径主要有：①提高根瘤菌固氮相关的固氮酶、吸氢酶等基因的表达水平。 ②降低土壤中铵离子对根瘤菌固氮能力的抑制作用。 ③增加宿主对根瘤菌碳源和能源的供应。 固氮是一个非常复杂的过程，需要许多不同蛋白质的协调作用。 nifA基因是绝大多数固氮细菌固氮酶基因的正调节基因。 NifA蛋白不但能够与固氮酶基因 nifHDK启动子结合，提高其转录效率，而且调控根瘤菌的结瘤能力。 nifA基因的突变体不仅造成固氮酶活性的丧失，而且引起结瘤能力严重降低。 相反，当引入了多拷贝的 nifA基因后，根瘤菌的固氮酶活性和结瘤能力都 有显著的提高。 当环 348 境中存在铵盐时，根瘤菌的固氮能力就明显降低，通过研究发现，这种现象是由于铵离子抑制了 nifA基因的表达造成的，由此构建了不受铵阻遏的组成型表达的 nifA质粒，将其引入根瘤菌中，得到了固氮作用不受铵阻遏的基因工程菌。 在美国，基因组中整合了外源 dctABD基因的重组苜蓿根瘤菌能提高大田苜蓿产量，是世界上首例通过了遗传工程菌安全性评价并进入有限商品化生产的工程根瘤菌。 我国研制的重组 大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum) HN32已 通过农业部农业转基因生物安全评价审批进行 环境释放，该菌是世界上第二例获准进行环境释放的重组根瘤菌。 二、食品和工业基因工程菌 （ 一 ） 乳酸菌基因工程菌 乳酸菌是一类以乳酸发酵为基本特征的革兰氏阳性菌群 ， 包括 乳酸杆菌 (Lactobacillus)、 乳球菌(Lactococcus)、 链球菌 (Streptococcus)、 片球菌 (Pediococcus)和 明串球菌 (Leuconostoc)五个菌属。 乳酸菌具有下列共同特性：都能在较低的 pH值及厌氧条件下良好生长，其生长需要碳水化合物、氨基酸和维生素等多种营养成分；并能利用碳水化合物生产大量的乳酸，产乳酸量 通常占发酵最终产物的50%以上；几乎所有的乳酸菌都是非致病性的。 乳酸菌基因工程的改良主要包括三个方面： ① 提高生产菌在食品发酵过程中的稳定性。 要求工程菌对噬菌体具有抗性，乳糖代谢和蛋白酶合成基因能全程稳定表达，从而提高乳糖的利用率，这在奶酪生产中极为重要； ② 改善发酵食品的品质。 控制蛋白酶基因的表达程度可以优化发酵乳制品的组成，提高其营养价值；在生产菌中导入某些天然香料的生物合成基因以及甜味蛋白或多肽基因，可以改善产品的风味和口感； ③ 缩短生产时期。 在详尽了解乳酸杆菌代谢机制的前提下，重新设计乳糖发酵与其它细菌生长所必需的代谢途径之间的物流控制，最大限度地提高生产菌的生长速度，同时阻止乳酸合成途径或强化表达杀菌素合成途径，以增加乳制品的保鲜期。 （二） 生产食品添加剂的基因工程菌 1． 氨基酸工程菌 氨基酸在食品工业具有广泛的用途，可以用作增鲜剂 (味精 )、抗氧化剂和营养补充剂，在其他行业用途也很广泛。 目前，全世界每年的氨基酸产量超过百万吨，销售额达几十亿美元，其中谷氨酸的产量占氨基酸总产量的一半以上。 氨基酸的大规模工业化生产，主 要有蛋白质降解和微生物发酵两种方法。 用于大规模发酵生产氨基酸的高产菌株以前是利用传统诱变技术改良 棒杆菌(Corynebacterium spp.)的野生株，现在主要是利用 DNA重组技术建构高产工程菌，相对传统诱变技术而言，其优点是：①能特异性地高效表达氨基酸生物合成途径中的限速步骤控制基因；②能将氨基酸的生物合成控制在细菌的最。