生物技术制药总结完整版

生物技术制药总结完整版内容摘要：

（ 1）质粒（ plasmid）载体 : 质粒大小一般 1~300kb  克隆的质粒载体  允许外源的 DNA 插入，储存。 主要是 DNA 水平上的操作。  基因表达的质粒载体  允许外源 DNA 的插入、储存和表达。 作为载体的质粒都含有三种共同的组分： 复制基因 (Ori)、选择性记号 (Amp,Kana)、多克隆位点 (MCS) （三）目的基因常用制备方法 (重点内容 ) —— 较短的基因 100bp 法 —— 可以在体外特异性地扩增目的基因片段  适用于克隆序列清楚的基因  以基因组 DNA 为模板，直接进行 PCR 扩增较难  多采用以 mRNA 为模板的 RTPCR 法 :  基因文库：是指某一特定生物体全部基因组的克隆集合，包括所有外显子和内含子序列。  基因文库的构建：鸟枪法（ shotgun) 文库法 cDNA ： 为具有与某 RNA 链呈互补的碱基序列的单链 DNA， 或此 DNA 链与具有与之互补的碱基序列的 DNA链所形成的 DNA 双链。 cDNA 文库 ： 指某生物某发育时期所转录的全部 mRNA， 经反转录形成的 cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。 (四）载体 DNA 与目的基因的连接 【 连接方法，其各自优缺点 】 DNA 分子体外重组： 连接酶催化载体 DNA 与目的基因 DNA 片段连接。 形成重组子的过程。 1. 粘性末端的连接： 经双酶切获得粘性末端，用连接酶进行连接 ：连接效率低，一般采用加尾法、接头法 ：目的基因与载体 DNA 的摩尔比大于 1 （五）重组 DNA 导入宿主细胞  宿主细胞： 原核细胞：大肠杆菌、枯草杆菌链球菌 真核细胞：酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞、植物细胞  原核细胞的转化方法： 电穿孔转化法 化学转化法 重组 DNA 导入菌种 特点 导入方法 大肠杆菌 表达产物的形式：细胞内不溶性表达（包含体）、胞内可溶性表达、细胞周质表达，极少还可分泌到胞外表达。 不同的表达形式具有不同的表达水平，且会带来完全不同的杂质。 氯化钙转化法、转染法 哥，只是一个传说 生物技术制药 2020 年五月 11 酵母 ，简化了分离纯化工艺。 电转化法 链霉菌 不致病、使用安全，分泌能力强，可将表达产物直接分泌到培养液中，具有糖基化能力，可做理想的受体菌。 原生质体转化法 哺乳类细胞 产物是糖基化的，接近或类似于天然产物。 但动物细胞生产慢，生产率低，而且培养条件苛刻，费用高，培养液 浓度较稀。 （八） 重组子的筛选与鉴定 抗生素抗性筛选法 （缺点是假阳性高） 、互补筛选法（蓝白斑筛选）、 营养缺陷型筛选法、噬菌斑筛选法： 菌落 (或噬菌斑 )原位杂交、 DNA 印迹分析、 Northern 印迹 序列测定 （七）原核细胞表达的特点及选择 （重点） 1. 外源基因表达的调控元件 启动子 :是 DNA 链上能与 RNA 聚合酶结合并起始 mRNA 合成的一段序列 i. plac 启动子 : 最早应用于的表达系统是 Lac 乳糖操纵子 ii. ptrc 启动子 : 是 trp 启动子和 lac 启动子的拼合启动子 iii. λ PL:λ噬菌体的转录启动子 PL,该启动子受控于λ噬菌体 cI 基因产物 iv. T7 启动子 : 是当今大肠杆菌表达系统的主流 核糖体结合位点 (rbs): 原核微生物的 mRNA 结合核糖体的序列称为 SD 序列 终止子：是基因 3‘端可被 RNA 聚合酶识别并停止转录功能的特定序列 哥，只是一个传说 生物技术制药 2020 年五月 12 大肠杆菌 表达可定位于胞内、周质、胞外 ， 胞内表达率高，但易行成包涵体 表达形式 特点 图例 胞内表达 非融合蛋白的胞内表达 表达非融合蛋白的操纵子必须改建成：细菌或噬菌体的启动子 细菌的 RBS真核基因的 AUG结构基因 *。 易被蛋白酶破坏； N 端有甲硫氨酸，易引起免疫反应 融合蛋白的表达 融合蛋白氨基端是原核序列 ， 羧基端是真核序列；优点：操作简便，蛋白质在菌体内比较稳定 ， 易高效表达； 分泌型表达 目标蛋白在周质空间中表达，有利于分离纯化和减少蛋白水解酶的降解。 目标蛋白从细胞质转运到周质空间过程中信号肽被加工切除，有效地避免了 N 端附加的甲硫氨酸的产生。 周质空间中呈氧化型的氧化还原态势使目标蛋白能够较好折叠，维持正确的构象。 1) 外源基因密码子的使用 2) mRNA 的结构： 3) 表达载体的选择 4) 外源蛋白的稳定性 （八）真核细胞表达的特点及选择 （重点）  酵母表达系统  昆虫细胞表达系统  哺乳类细胞表达系统 1. 酵母表达系统 巴斯德毕赤酵母 影响外源基因的在酵母中表达的因素 影响因素 特点 1 外源基因的结构  mRNA 的 5‘端非翻译区（ 5‘UTR）的序列和长度  起始密码子旁侧序列  富含 A/T 序列导致提前终止  偏爱密码子  胱氨酸的含量 2 表达形式及信号肽的选择  大多选择分泌表达：  但是信号肽具有选择性，所以选择合适 的信号肽对于提高某种重组蛋白质的表达量是非常重要的。  标准的分泌信号肽 OLMF 和 PHO1，但在表达某些外源基因中失灵 3 启动子  醇氧化酶 1（ AOX1）基因的启动子，是目前最强，调控机理最严格的启动子之一，用甲醇可严格地调控外源基因的表达  常见的表达载体有 pPIC pPIC pHILD pA080 pA081 pPSC3K等，均为整合型载体 哥，只是一个传说 生物技术制药 2020 年五月 13 4 转化子的拷贝数  拷贝数越高，其产量越高。 但存在负效应，会引起细胞生长量的降低 5 诱导条件  甲醇诱导的时间、浓度、温度的选择 6 外源蛋白的降解  选用蛋白酶缺失型宿主菌 杆状病毒表达系统是目前应用最广的昆虫细胞表达系统，该系统通常采用目宿银纹夜蛾杆状病毒 (AcNPV)作为表达载体。  昆虫细胞表达系统的优点：  可表达较大的外源基因  可表达不同生物来源的外源基因  与高等生物相似的转录后加工、修饰  杆状病毒具有高度宿主专一性 昆虫细胞表达系统，特别是杆状病毒表达系统由于其操作安全，表达量高，目前与酵母表达系统一样被广泛应用于基因工程的各个领域中。 由哺乳动物细胞翻译后再加工修饰产生的外源蛋白质，在活性方面远胜于原核表达系统及酵母、昆虫细胞等真核表达系统，更接近于天然蛋白质。 但利用哺乳动物细胞表达系统表达外源蛋白，其产量还不高，难以满足大规模的实际应用。  将外源基因导入哺乳动物细胞的方法 ：  感染性病毒颗粒感染宿主细胞  通过脂质体法、显微注射法、磷酸钙共沉淀法及 DEAE 一葡聚糖法等非病毒载体的方式将基因导入到细胞中。  哺乳动物细胞表达系统常用的宿主细胞  CHO、 COS、 BHK、 SP2/0、 NIH3T3 等，不同的宿主细胞对蛋白表达水平和蛋白质的糖基化有不同的影响，因此在选择宿主细胞时应根据具体情况而定。 二、基因重组蛋白的分离纯化与分析鉴定 （了解内容，略 有空自己 look look书上 P80 呗） 第二节 基因工程药物研发中的特殊要求 （仍然了解内容，书上 P 91） 真核细胞表达制品的安全性的问题 （居然是掌握 = =）  由真核细胞生产的产品可能存在  与肿瘤相关的 DNA  病毒 DNA 尤其是逆转录病毒  我国目前规定：每剂量的药物所含 DNA 不得大于 100pg。 基因工程药物稳定性研究的相关问题  影响生物制品的因素： 1. 药物浓度：蛋白在低浓度下易失活 — 与化学药物不同，改变剂型时要重新鉴定其稳定性 2. 温度：升温加速实验不适合于生物制品 3. 湿度：应低于 13％ 4. 氧：应测定在有氧环境中的稳定性，采用密封包装 5. 光照：应测定光解作用的影响，采用遮光包装 6. pH：应测定 pH 的影响 第四章 动物细胞工程制药 第一节 概述  动物细胞工程制药所涉及的主要技术领域包括细胞融合技术、细胞核移植技术、动物细胞反应器，哥，只是一个传说 生物技术制药 2020 年五月 14 动物克隆，染色体改造，基因转移，转基因动物技术和细胞大规模培养技术等方面；最基本的有 细胞融合技术、转基因动物技术和细胞大规模 培养技术三项技术 动物细胞的培养特征（了解） ，无细胞壁，抗机械强度低，对剪切力敏感，适应环境能力差。 ，生长 缓慢，易污染，培养时添加抗生素 ，有些需 CO2。 动物细胞的分类； 1. 贴壁依赖性细胞 :包括成纤维细胞型，上皮细胞型。 生长于支持物表面。 2. 非贴壁依赖性 /悬浮细胞 ：这类细胞培养时不贴附于支持物上，可在培养液中悬浮生长。 来源于血液、淋巴组织，许多肿瘤细胞等均属于此类。 细胞一般呈圆形。 有些细胞呈现双重性，既可以贴壁生长，也可以悬浮培养。 如中国仓鼠卵巢细胞，小鼠 L929 细胞 ， CHO细胞 第二节 生产用动物细胞 一、生产用动物细胞的获得 （一）非基因工程细胞的获得 原代细胞 传代细胞系 转化细胞系 定义 直接取自动物组织、器官，经过粉碎、消化而获得的细胞悬液 原代细胞经过传代、筛选、克隆，从多种细胞成分的组织中挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株 通过某个转化过程形成的，失去正常细胞的特点。 由于染色体的断裂变成异倍体，获得无限增殖的能力得到的细胞 特点 增殖能力有限，需要大量的动物才能增加产量，费钱费劳力 , 限制了它的应用。 动物细胞生产生物药品的早期，一般用原代培养的细胞来生产疫苗，如鸡胚细胞、原代兔肾细胞、鼠肾细胞、淋巴细胞等 适合药物检测 染色体组型是 2n 的核型 ,二倍体细胞系 具有贴壁依赖和接触抑制的特性 有限的增殖能力， 50 代 无致瘤性 一般从胚胎中获得，有限传代 自发的：正常细胞中自发的转化形成有无限生命力的细胞系；多发生于啮齿类细胞动物 人为转化：采用某些病毒 SV40 或某些化学试剂 从动物肿瘤组织中建立的细胞系 转化细胞为永生化细胞，无限细胞系，连续细胞系。 转化细胞具有无限生命力，倍增时间短，对培养条件和生长因子等要求低，更适于大规模工业化生产 （二）基因工程细胞系的构建 【大体构建流程】 基因工程细胞系：用基因工程技术或细胞融合技术对宿主细胞的遗传物质进行修饰改造或重组，获得具有稳定遗传的独特性状的细胞系 ， 分杂种细胞和重组细胞 基因工程细杂种细胞 细胞融合 （仙台病毒、聚乙二醇 50%、物理方法：电击法，激光法） → 杂种细胞筛选 细胞融合后，除目的杂种细胞外，还有同合体细胞和未融合的亲本细胞 筛选方法：（ 1）营养缺陷型细胞系或抗性细胞系作为融合的亲本细胞，选择培养基来筛选 （ 2）利用或人为制造两个亲本细胞的物理差异，如大小，密度等进行筛选 （ 3）利用或人为制造杂种细胞与未融合细胞生化或分生能力的差异，进行筛选。 哥，只是一个传说 生物技术制药 2020 年五月 15 胞系的构建 重组细胞 包括 CHO， BHK21,SP2/0， Vero 细胞等 ， 最多用的是 CHO 细胞 表达载体的构建 （外源基因在动物细胞中高效表达，首先要将其构建在高效表达载体内，表达载体两类： ，牛痘病毒、腺病毒、反转录病毒和杆状病毒 b. 质粒载体 —— 穿梭质粒载体 (选择性标记 +增加拷贝数基因 )） → 基因载体的导入 → 高效表达工程细胞株的筛选 (Neor: G418。 tk+：胸腺嘧啶激酶 hgprt+：次黄嘌呤 ) 牛痘病毒感染细菌 (牛痘启动子 amp。 重组基因 )— 转化 — 培养 — 收集 杆状病毒首先和质粒一起在细胞中培养；质粒“感染”病毒 得到的重组病毒再去转染其他细胞 (重组 DNA 病毒介导法 ) 附： PEG： 主要用于生产单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备 二、制药工业中常用的动物细胞（详见课本 118 表 43） 细胞名称 来源 特性 培养条件 用途 W138 正常肺组织，成纤维细胞 2N BME+10%小牛血清 制备疫苗 Vero 非洲绿猴肾脏，贴壁成 2N=60 199+5%胎牛血清 增殖病毒，产疫苗，。