生物技术复习题

生物技术复习题内容摘要：

，从而对后继的亚克隆及其他操作造成麻烦。 C. DNA 接头连接法 ：优点： 一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端，另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。 当它的平末端与平末端的外源 DNA 片段连接后，便会使后者成为具有粘性末端的 新的 DNA 分子，而易于连接重组； 缺点 ：各个 DNA 接头分子的粘性末端之间，会通过互补碱基间的配对作用，形成如同 DNA 衔接物一样的二聚体分子，失去接头的本来意义。 （ 克服的方法是将 5‗末端的磷酸修饰移去，其结果为暴露出的 5‘OH所取代。 如此一来，虽然两个接头分子粘性末端之间仍具有互补碱基配对的能力，但终因DNA连接酶无法在 5‗OH和 3‘ –OH之间形成磷酸二酯键而不会产生出稳定的二聚体分子。 ）。 ① 分离纯化需改造的目的蛋白； ② 了解其一级结构及高级结构，了解其结构 功能关系； ③获 取编码该蛋白的基因序列； ④ 设计改造方案； ⑤ 对基因序列进行改造； ⑥ 将经过改造的基因序列重组入表达载体，进行表达；⑦分离纯化表达产物，并对其功能进行检测。 补充： 1． 限制酶： 凡能识别并切割双螺旋 DNA 分子内特定核苷酸顺序的酶统称为限制酶。 2． 基因工程新技术 ：蛋白质工程，反义药物， RNAi 技术，新生物技术疫苗。 ：①目的抗原基因的选择和获得（构建 cDNA 文库， PCR 扩增，人工合成）；②选择合适的表达载体；③对在表达载体上的基因序列进行测定。 ：① 随机酶切成较大的 DNA 片段（ 10~30Kb，平均 20Kb)，对这些片段进行分离； ② 重组入适当载体（噬菌体）； ③ 转化进宿主菌（ )，扩增，构建成基因文库；④ 从基因组文库中筛选出含有目的基因组的重组子。 技术： 是指在四种脱氧核苷三磷酸（ dNTP）存在下，以寡聚核苷酸为引物，以单链DNA 为模板，经 DNA 聚合酶催化，合成 DNA 互补链达到基因扩增目的的过程。 PCR 反应的必要条件 ：须知基因两端的部分序列 PCR 反应中的几个关键因素 ： Taq DNA 聚合酶 ； 引物的长度 ； 模板。 ： 是人工构建的，含有λ DNA 的粘性 (cos)末端序列、质粒复制起始区及质粒一个抗药性标记的、兼具质粒与λ噬菌体 DNA 载体双重性质的特殊载体。 生物技术复习题 07437 9 酶工程 一、 专业符号及名词解释 1. NADPH 还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 2. DEAE 二乙氨乙基葡聚糖 3. DNP 二硝基苯酚 4. error prone PCR 易错 PCR 5. DNA shuffling DNA 改组 6. IU 酶活力国际单位 7. Katal 酶活力单位 8. 酶工程 指通过化学方法、酶学方法和 DNA 重组技术改善自然酶的组成、结构和性质，以提高酶的催化效率、降低成本并在大规模工业化生产中进行应用的技术 9. 酶的活力单位 酶在最适条件下，单位时间内，酶催化底物的减少量或产物的生成量 （ IU：指在特定条件下， 1min 内生成 1μ mol 产物的酶量） 每毫克酶蛋白所含的酶活力单位数 酶的比活力 =酶活力单位数 /毫克酶蛋白 （ Immobilized enzyme） 通过物理和化学的方法将酶束缚在一定空间内且仍具有催化活性的酶 制剂 （ Immobilized cell） 指被限制或定位于特定空间位置的细胞，与固定化酶一起统称为固定化生物催化剂。 固定化酶活力下降为原初活力一半时所经历的连续操作时间称为其操作半衰期，其长短显示出固定化酶操作稳定性的高低 固定化反应过程中 载体结合蛋白质的能力称为偶联效率 偶联效率（ %） =（加入的总酶蛋白量－上清液残留总蛋白量） /加入的总酶蛋白量 100% 偶联效率（ %） =（加入的总酶活力－上清液残留总酶活力） /加入的总活力 100% 收率 偶联反应后，固定化酶所显示的活力与加入偶联液中酶的总活力的比值 活力回收率（ %） =固定化酶总活力 /加入偶联液总酶活力 100% 已被固定化的酶的活力与同样蛋白质量的天然酶活力的比值 相对活力（ %） =固定化酶总活力 /（加入酶总活力－上清液中未偶联酶总活力） 100% 以酶（游离酶或固定化酶）作为催化剂进行酶促反应所需的设备 在分子水平上对酶进行改造，即在体外将酶的侧链基团通过人工方法与一些化学基团，特别是具有生物相容性的大分子进行共价连接，从而改变酶的酶学 性质的技术。 以固定化的 生物成分（如酶、蛋白质、 DNA、抗体、抗原）或微生物体本身（如细胞、微生物、组织等）为敏感材料，与适当的化学换能器相结合，用于快速检测物理、化学、生物量的新型器件 生物技术复习题 07437 10 酶在非水相（也称为非水介质）中也具有催化活性，可以在含有多种有机溶剂和微量水分的非水介质中发挥催化作用 抗体酶又称催化抗体（ catalytic antibody），是一类具有抗体的高度特异性又具有酶的高效催化活性的蛋白质分子 能在极端环境中生长的微生物 叫做极端微生物。 极端环境指普通微生物不能生存的环境，如高温、低温、低 PH、高 PH、高盐、高辐射、含抗代谢物、有机溶剂、低营养、重金属及有毒有害物等环境条件 二、 填空题 酶分子的 主链修 饰 、 酶分子的 侧链基团修饰 、 酶分子的 化学交 联修饰 、 酶分子的 大 分子修饰 、 酶分子的 亲 和标记修饰 、 酶分子的 基 因修饰 和 与辅助因子相关的修饰。 诱导法 、 引入法 、 拷贝法 和 抗体库法。 年国际生物化学联合会酶学委员会根据反映类型 ，将酶类分为 氧化 还原酶 、 转移酶 、 水解酶 、 裂合酶 、 异构酶 、和 连接酶。 三、 问答题。 什么是酶工程。 酶具有以下特性： 酶是蛋白质； 酶的催化效率非常高 ； 酶具有高度的专一性； 酶的反应条件温和（常温、常压） ； 酶的催化活性受到调节和控制。 酶工程 ：指通过化学方法、酶学方法和 DNA 重组技术改善自然酶的组成、结构和性质，以提高酶的催化效率、降低成本并在大规模工业化生产中进行应用的技术 ，试对各种方法进行综合比较。 ① 吸附法 ： 分为物理吸附法及离子交换剂吸附法。 优点： 操作简单，可选用带不同电荷和不同形状的载体，固定化过程可以与纯化过程同时实现，酶失活后载体仍可再生。 缺点： 最适吸附酶量无规律遵循，对不同载体和不同酶的吸附条件不同，吸附量与酶活力不一定呈平行关系。 酶与载体之间结合力不强，酶易于脱落，导致酶活力下降并污染产物。 ② 共价结合法 ： 酶分子的活性基团与载体表面活泼基团之间经化学反应形成共价键的连接法 常用基团： 氨基、羧基、酚基及咪唑基等 优点： 酶与载体结合牢固，操作稳定性良好。 缺点： 载体需活化，固定化操作复杂，反应 条件较剧烈，酶易失活并产生空间位阻效应。 ③ 交联法 ： 采用双功能或多功能试剂使酶分子内或分子间彼此连接成网络结构而使酶固定化的技术。 本法又分为（ 1）交联酶法、（ 2）酶与辅助蛋白交联法、（ 3）吸附交联法、（ 4）载体交联法 ④ 包埋法 ： 分为凝胶包埋法及微囊化包埋法两类 优点： 制备固定化酶的操作条件温和，不改变酶的结构，操作时保护剂及稳定剂均不影响酶的包埋率，适用于多种酶、粗酶制剂、细胞器及细胞的固定化。 缺点： 固定化酶只适用于小分子底物及小分子产物的转化反应，不适用于催化大分子底物或产物的反应。 由于扩散阻力将导致 酶动力学行为改变而降低活力 生物技术复习题 07437 11。 残留法、水解法。 构象效应、屏蔽效应（或称位阻效应）、微环境效应（或称分配效应）、扩散效应。 分批测定法、连续测定法 ，固定化酶具有哪些优点。 （ 1）稳定性较天然酶高 （ 2）反应后，酶与底物易于分开，并可长期反复使用 （ 3）反应液中无残留酶，产物易于纯化，产品质量高 （ 4）可实现转化反应连续化和自动化控制； （ 5）酶的利用效率高，产品成本低。 （ 6）转化反 应基本无三废排出，因此称之为 ―无公害酶 ‖ ，固定化细胞具有哪些优点。 （ 1）无需进行酶的分离纯化、减少起始投资； （ 2）细胞保持原初生命活动状态，固定化过程酶回收率高； （ 3）细胞内酶较固定化酶稳定性更高； （ 4）细胞内辅因子可以自动再生； （ 5）细胞本身含多酶体系，可催化一系列反应； （ 6）抗污染能力强。 ? ① 竞争性抑制 ： 与底物结构类似的物质能在酶的活性部位与酶结合，使酶促反应速率下降 ② 非竞争性抑制： 抑制剂可在酶的活性部位以外与酶结合，其结合与底物没有 竞争关系 ③ 反竞争性抑制 ： 抑制剂 I 仅与复合物 ES 作用生成底物 酶 抑制剂复合物 SEI。 从一个或多个已存在的亲本出发，利用 TaqDNA 多聚酶不具有 3‘→ 5‘校对功能，并结合基因工程现有技术，在待进化的酶基因的 PCR 扩增反应中，配合适当条件，以很低的比率向目的基因中随机引入突变，并构建突变库。 并凭借定向选择（筛选）方法，获得具有某些预期特征的进化酶，从而排除其它方向的突变体。 ，各自具有什么特点。 ① KS 型不可逆抑制剂： 具有与底物类似的结构，他们能与特 定的酶结合，它们的结构中还带有一个活泼的化学基团，可以与酶分子中的必需基团起反应，使酶活力受到抑制 ② Kcat型不可逆抑制剂： 结构中潜在着一种化学活性基团，当酶把它们作为一种底物来结合并在这一酶促催化作用进行到一定阶段以后，潜在的化学基团被活化，成为有活性的化学基团，并和酶蛋白活性中心发生共价结合，使酶失活 ，酶反应器可以分为哪几类，各自具有什么特点。 ① 间歇式反应器： 先把酶和底物一次性装入反应器，在适当温度、 PH 下反应，经一定时间后将全部反应物取出。 此法灵活性大，适合小批量、多品种的生产，并且 由于充分搅拌，使反应罐内底物和产物浓度、 温度 、 PH 处处相等且底物和产物浓度随反应时间而变化 生物技术复习题 07437 12 ② 半连续式反应器： 将底物溶液缓慢加入反应器而非一次性加入。 此法可以避免酶反应过程的底物抑制现象 ③ 连续式反应器： 一边连续地将底物溶液加入反应器中，一边连续地使反应液以相同流量排出反应器。 此法便于自动控制、反应条件恒定、产品质量稳定，所以适用。