微生物技术与应用核心知识

微生物技术与应用核心知识内容摘要：

（ Protoplast）：采用一定方法技术去掉细胞壁，剩下的细胞部分称之为原生质体。 原生质体融合（ Protoplast fusion）： 用物理、化学或生物学方法，诱导遗传特性不同的两亲本原生质体相互接触、融合，经染色体交换、重组而达到杂交目的，经筛选获得集双亲优良性状于一体的稳定融合子（ fusant）。 原生质体融合育种的优点： 杂交频率较高 链霉菌通过原生质体融合，后代的重组率达 1%，比准性重组率高 2020200 倍。 扩大重组的亲本范围 原生质体由于完全或部分去除了细胞壁，能实现常规杂交无法做到的 种种 间间 、 属属 间间 、 门门 间间 等远缘杂交。 提高菌株产量的潜力较大 原生质体融合时亲本整套染色体参与交换，遗传物质转移和重组性状较多，集中双亲本优良性 状机会更大。 原生质体融合育种步骤： 1．标记菌株的筛选和稳定性验证。 2．原生质体制备。 3．等量原生质体加聚乙二醇促进融合。 4．涂布于再生培养基，再生出菌落。 5．选择性培养基上划线生长，分离验证，挑取融合子进一步试验、保藏。 6．生产性能筛选。 （五） 基因工程育种 是指利用 DNA 重组技术 将 外源基因 导入到 微生物细胞 ，使后者获得前者的某些 优良性状 或表达前者的 基因产物 而获得 新种。 基因工程育种的特点： 打破了物种的界限，突破了亲缘关系的限制 可进行定向变 异和育种 可创造出自然界中原本没有的生物 基因工程育种的基本步骤 ： 目的基因的获得 选择目的基因的途径有 4种： ①选择适宜的给体细胞 ,以便从中采集分离到有生产意义的目的基因； ②通过反转录酶的作用由 mRNA 合成 cDNA(互补 DNA)； ③通过聚合酶链反应（ PCR），以基因组 DNA 或 cDNA 模板扩增得到目的基因片段； ④用化学方法合成特定功能的基因。 微生物技术应用 6 选择载体 载体（ Vector）是携带目的基因并将其转移至受体细胞内复制和表达的运载工具。 载体必 须具备下列几个条件 : ①是一个有自我复制能力的复制子。 ②能在受体细胞内大量增殖，有较高的复制率； ③最好只有一个限制性内切酶的切口 ,使目的基因能固定地整合到载体 DNA 的一定位置上； ④载体上必须有一种选择性遗传标记，如具有四环素、氨苄青霉素等的抗性基因 ,以便及时把极少数“ 工程菌 ” 选择出来。 目的基因与载体连接 获得目的 DNA 片段和载体 DNA 片段后，要把两者连接起来形成重组体。 目的基因与载体 DNA 均采用限制性内切酶处理，然后在 DNA 连接酶催化下，两条双链 DNA 片段相邻的 5’ 磷酸和3’ 羟基间形成磷酸二 酯键，形成一个完整的有复制能力的环状重组体。 在分子克隆中最有用的的 DNA 连接酶是来自 T4 噬菌体的 DNA 连接酶。 重组 DNA分子导入宿主菌 体外连接的重组 DNA 分子必须导入适当的受体细胞中才能大量的复制、增殖和表达。 根据所采用的载体的性质，将重组 DNA 分子导入受体可有不同的方法。 转化： 指以细菌质粒为载体，将外源基因导入受体细胞的过程。 转化时，细菌必须经过适当的处理使之处于感受态－即容易接受外源 DNA 的状态，然后利用短暂热休克使 DNA 导入细菌宿主中。 此外还可用电穿孔法转化细菌，它的优点是 操作简便、转化效率高、适用于任何菌株。 转染和感染： 利用噬菌体 DNA作为载体时可经两种方式导入受体菌。 一种是感染，即在体外将噬菌体 DNA 包装成病毒颗粒，然后使其感染受体菌。 另一种方式是转染，即在 DNA 连接酶作用下使噬菌体 DNA环化，再象重组质粒一样地转化进受体菌。 但习惯上常把以噬菌体 DNA 为载体构建成的重组子导入细胞的过程统称为转染。 阳性重组子的筛选、鉴定 长出的菌落不一定都是含有正确目的 DNA 片段的阳性重组子，因此需要从转化细菌菌落中筛选、鉴定出含有阳性重组子的菌落。 鉴定的方法有直接筛选法和分子生 物学间接筛选法。 前者利用可选择的遗传表型和功能如抗药性、蓝白斑、噬菌斑等可以直观、快速的在大量群体中进行筛选；后者根据目的基因的大小、核苷酸序列、基因表达产物的特性，用限制性酶切、分子杂交、核苷酸序列分析及表达产物分析。 第 3 章 发酵工艺 第一节 微生物发酵的一般流程 发发 酵酵 概概 念念 ：： 利用微生物，在适宜的条件下，将原料经过特定的代谢途径转化为人类所需要的产物的过程。 空气 空气净化处理 保藏菌种 斜面活化 扩大培养 种子罐 主发酵 碳源、氮源、无机盐等营养物质 产物分离纯化 成品 灭菌 微生物技术应用 7 发发 酵酵 类类 别别 ：： 根据对氧的需要区分：厌氧和有氧发酵 根据培养基物理性状区分：液体和固体发酵 根据微生物生长 特性区分：分批发酵和连续发酵 发发 酵酵 的的 一一 般般 流流 程程 (1)用作培养菌种及扩大生产的发酵罐的培养基的配制； (2)培养基、发酵罐以及辅助设备的消毒灭菌； (3)将已培养好的有活性的纯菌株以一定量转接到发酵罐中； (4)将接种到发酵罐中的菌株控制在最适条件下生长并形成代谢产物； (5)将产物抽提并进行提纯，以得到合格的产品； (6)回收或处理发酵过程中产生的废物和废水。 培培 养养 基基 的的 配配 制制 ：广义上讲培养基是指一切可供微生物细胞生长、繁殖所需的一组营养物质和原料。 ： 满足菌体的生长 促进产物的形成 （ 1）碳源 作用 提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源和合成菌体所必需的碳成分；提供合成目的产物所必须的碳成分。 来源 糖类、油脂、有机酸、正烷烃 工业上常用的糖类： ① 葡萄糖 ： 所有的微生物都能利用葡萄糖，但是会引起葡萄糖效应； ② 糖蜜：糖蜜是制糖生产时的结晶母液，它是制糖工业的 副产物。 糖蜜使用的注意点： 除糖份外，含有较多的杂质，其中有些是有用的，但是许多都会对发酵产生不利的影 响，需要进行预处理。 ③ 淀粉、糊精 缺点： 难利用；发酵液比较稠、一般 %时加入一定的α 淀粉酶；成分比较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等等。 优点： 来源广泛、价格底；难利用，可以解除葡萄糖效应。 注：不同碳源对微生物自身生长、发酵过程及产物会产生不同的影响。 （ 2）氮源 作用： 氮源主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸，蛋白质、核酸等）和含氮代谢物。 常用的氮源可分为两大类： 有机氮源和无机氮源。 无机氮源 无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，这种 经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源叫 生理酸性物质 ，如硫酸胺，若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为 生理碱性物质 ，如硝酸钠。 有机氮源 成分复杂： 除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机盐及生长因子。 氮源使用的一些相关问题： 有机氮源和无机氮源应当混合使用 早期：容易利用易同化的氮源 — 无机氮源 中期：菌体的代谢酶系已形成、则利用蛋白质 有些产物会受氮源的诱导和阻遏 有机氮源选取时也要考虑微生物的同化能力 开发效果好、有针对性的有机氮源仍然是令人感兴趣的课题 （ 3）无机盐的微 量元素 使用注意点： 必须加以考虑； B、使用时注意盐的形式（ pH 的变化） （ 4）生长因子、前体和产物促进剂 生长因子： 凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。 前体： 指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中合成到产物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。 产物促进剂 ： 是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的 添加剂。 （ 5）水 水源质量的主要考虑参数包括 pH 值、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。 ① 培养基能够满足产物最经济的合成。 ② 发酵后所形成的副产物尽可能的少。 ③ 培养基的原料应因地制宜，价格低廉；且性能稳定，资源丰富，便于采购运输，适合大规模储藏，能。