生物化学分子生物学经典实验技术

生物化学分子生物学经典实验技术内容摘要：

低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。 将凝胶转移至电泳槽中。 ，接通电源，起始时用的低电流（ 5mA/gel/17cm）或低电压，待样品在完全走出 IPG 胶条，浓缩成一条线后，再加大电流（或电压）（ 2030mA/gel/17cm），待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。 ，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并 切角以作记号（戴手套，防止污染胶面）。 酵母双杂交 (一 ) 基本原理 酵母双杂交系统由 Fields 和 Song 等首先在研究真核基因转录调控中建立 i。 典型的真核生长转录因子， 如 GAL GCN等都含有二个不同的结构域 : DNA结合结构域 (DNAbinding domain)和转录激活结构域 (transcriptionactivating domain)。 前者可识别 DNA上的特异序列， 并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游， 转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用， 启动它所调节的基因的转录。 二个结构域不但可在其连接区适当部位打开， 仍具有各自的功能。 而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。 酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。 主要有二类载体 : a 含 DNA binding domain 的载体。 b 含 DNAactivating domain 的载体。 上述二类载体在构建融合基因时， 测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。 融合基因在报告株中表达， 其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。 例如 GAL4bd 具有核定位序列(nuclearlocalization sequence)， 而 GAL4ad 没有。 因此， 在 GAL4ad 氨基端或羧基端应克隆来自 SV40 的 T抗原的一段序列作为核定位的序列。 目前研究中常用 bindingdomain 基因有： GAL4(1147)。 LexA (E coli 转录抑制因子 )的 DNAbd 编码序列。 常用的 activatingdomain 基因有： GAL4(768881)和疱疹病毒 VP16 的编码序列等。 双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。 报道株指经改造的、含报道基因 (reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。 最常用的是酵母细胞， 酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点 : 〈 1〉 易于转化、便于回收扩增质粒。 〈 2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。 〈 3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。 一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA－结合结构域 (如 GAL4bd， LexAbd)； 另一个基因融合到转录激活结构域 (如 GAL4ad， VP16)。 激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中， 蛋白间的作用使得转录因子重 建导致相邻的报道基因表达 (如 lacZ)， 从而可分析蛋白间的结合作用。 酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用， 具有高度敏感性。 主要是由于： ① 采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。 ② 信号测定是在自然平衡浓度条件下进行， 而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤，降低了信号强度。 ③ 杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强， 后者又与启动子 DNA 结合， 此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。 ④ 通过 mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。 同时， 酵母表型 ， XGal及 HIS3 蛋白表达等检测方法均很敏感。 (二 ) 酵母双杂交系统的应用 1 特点与优点 酵母双杂交系统的最主要的应用是快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基因。 酵母双杂交系统检测蛋白之间的相互作用具有以下优点 : ⑴ 作用信号是在融合基因表达后， 在细胞内重建转录因子的作用而给出的， 省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。 ⑵ 检测在活细胞内进行， 可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。 ⑶ 检测的结果可以是基因表达产物的积累效应， 因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或 暂时的相互作用。 ⑷ 酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建 cDNA 文库， 能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。 例如已报道成功分析了 RAP1 与 RIF1ii、 P21cip1 与 CDK2iii、 p16与 CDK4iv等之间的相互作用。 2 结构组成 酵母双杂交系统可应用于确定两已知有生理作用的蛋白间的作用位点或结构域。 利用此系统已分析和测定了多种重要结构域， 如 p85 三磷酸肌醇激酶和 p110 亚单位作用的结构域 v， p21cip1 蛋白与增殖细胞膜抗原 (proliferatingcell nuclear antigen， PCNA) 的结合序列 vi 等。 此外酵母双杂交系统还应用于阐明蛋白质相互作用的结构域，绘制蛋白质联系图谱，在药物设计等许多方面。 (三 ) 酵母双杂交系统局限性和存在的。