烟草实验操作手册-

烟草实验操作手册-内容摘要：

HCl 35 ml 01 间苯二酚 1 ml 摇匀后于 80℃保温 10 min 冷却后 480nm 处比色测定蔗糖生成的量 4 标准曲线制作取 7 支 10ml 具塞试管并按下表加入各种试剂按上述步骤 3反应并测定其吸光度以吸光度值为纵坐标蔗糖含量为横坐标绘制标准曲线以计算反应中蔗糖形成的数量 试剂 管号 1 2 3 4 5 6 7 1mgml 蔗糖标准液 ml 0 01 02 04 06 08 1 蒸馏水 ml 1 09 08 06 04 02 0 蔗糖含量 mg 0 01 02 04 06 08 1 A480 5 结果计算 蔗糖合酶活力 mg 蔗糖 gFWL CVtn FWtVs 式中 C 是从标准曲线查得的蔗糖量 mg FW 是样品鲜重 g t 是反应时间 h Vt 是提取酶液总体积 ml Vs 是测定时取用酶液体积 ml n 是提取液测定中的稀释倍数 注透析袋不可装满以防止吸水涨破 25 谷氨酸丙酮酸转氨酶的测定孔霖赖氏比色法 一 方法原理 谷氨酸丙酮酸转氨酶 间作 GPT 是植物体内最普遍的转氨酶其催化下述反应 GPT L 谷氨酸 丙酮酸→ L 丙氨酸α 酮戊二酸 植物酶粗提液中 GOT 对基质中门冬氨酸和α 酮戊二酸反应起催化作用在一定的反应条件下产生一定量的草酰乙酸草酰乙酸随之脱羧成为丙酮酸 Pyruvic acid 简写 Pyr 反应至规定时间后加入 2 4 二硝基苯肼及盐酸溶液终止反应同时 2 4 二硝基苯肼与酮酸中羰基加成生成丙酮酸苯腙在碱性条件下苯腙呈红棕色其颜色深浅与丙酮酸含量在一定范围内成正比可用分光光度计以 500nm 波长进行比色测 定丙酮酸含量以确定 GOT 活度 酶粗提液中 GPT 作用于基质中丙氨酸和α 酮戊二酸生成丙酮酸及谷氨酸酶促反应达到规定时间后加 2 4 二硝基苯肼及盐酸溶液终止反应再按上法测定丙酮酸含量来确定 GPT 活度 二 主要仪器与试剂 1 主要仪器设备 高速离心机 恒温水浴锅 722G 分光光度计 2 主要试剂 1 0 05mol L Tris HCL 缓冲液 pH7 2 0 2mol L 三羟甲基氨基甲烷 24 2g 三羟甲基氨基甲烷用蒸馏水溶解并定容至 200ml 50ml 和 0 2mol L HCl 44 2ml 用蒸馏水稀释至 200ml 2 0 1mol L 磷酸盐缓冲液 称取磷酸氢二钠 AR 11 928g 磷酸二氢钾 AR 2 176g 加少量蒸馏水溶解并定容至 1000ml 3 2 4 二硝基苯肼溶液称取 2 4 二硝基苯肼 19 8mg 用 10mol L HCL10ml 溶解后加蒸馏水至 100ml 保存于棕色瓶中备用此液可保存 3 个月 4 04mol L 氢氧化钠溶液 16g 氢氧化钠 AR 加蒸馏水溶解并定容至1000ml 5 1 mol L 氢氧化钠溶液 40g 氢氧化钠 AR 加蒸馏水溶解并定容至1000ml 6 丙酮酸标准液 2μ mol ml 精确称取纯丙酮酸钠 22 0mg 于 100ml 容量瓶中加 0 1mol L 磷酸盐缓冲液至刻度此液应新鲜配制 7 GPT 底物液 DL 丙氨酸 200mmol L α 酮戊二酸 2mmol L 称取α 酮戊二酸 29 2mg 和 DL 丙氨酸 1 79g 置于一小烧杯中加入 0 1mol L 磷酸盐缓冲液 pH7 4 约 80ml 煮沸溶解后待冷用 1mol L 氢氧化 钠调 pH 至 7 4 约加 0 5ml 再加 0 1mol L 磷酸盐缓冲液至 100ml 混匀加氯仿数滴防腐贮于冰箱内 三 操作步骤 1． 酶粗制剂的提取 将新鲜植物材料剪碎取鲜重 0 2g 左右放入研钵加 0 05mol L Tris HCl 缓冲液 pH7 2 2 0ml 在冰浴中研磨得到的匀浆用高速离心机 20200 g 离心 20min 上清液供测酶活度用 2 谷丙转氨酶 GPT 活度测定 取 10ml 试管 2支一支作测定管分别加酶粗制剂 0 1ml 和 GPT 底物液 0 5ml 另一支作对照管仅 加酶粗制剂 0 1ml 将二管同时置 37 ℃水浴 30min 后取出各管加 2 4 二硝基苯肼液 0 5ml 终止反应对照管再加 GPT 底物液 0 5ml 将二管再置 37 ℃水浴中 20min 取出后各管加 0 4mol L NaOH 5 0ml 混匀 10min 后用分光光度计比色波长 500nm 蒸馏水调零点读取吸光度将测定管吸光度减去对照管吸光度得吸光度差值查工作曲线即可查得丙酮酸体积 ml 若查得的丙酮酸体积超过 0 2ml 时应将酶粗制液稀释后再进行测定测定结果乘以稀释倍数即得丙酮酸体积 V ml 工作曲线绘制 取 10ml 试管 6 支各管加 0 1molL 磷酸盐缓冲液 0 1ml 分别加 GPT 底物液 0 5 045 0 40 0 35 0 30 0 25ml 丙酮酸标准液 0 对照管 0 05 0 10 0 15 0 20 0 25ml 置 37 ℃水浴中 5min 各管加 2 4 二硝基苯肼溶液 0 5ml 混匀再置 37 ℃水浴中 20min 取出后各管加 0 4mol L 氢氧化钠溶液5ml 混匀 10min 后同上比色读取各管吸光度各管吸光度分别减去对照管吸光度以各管丙酮酸体积为横座标以相应的吸光度差值为纵座标绘 制工作曲线 四 结果计算 转氨酶活度以每克植物鲜样在 30min 内反应生成的丙酮酸微摩尔 μ mol 表示 GPT 活度μ mol g 30min C V 20 m 2 式中 C 丙酮酸标准溶液的浓度 μ mol ml V 由工作曲线查得的丙酮酸体积 ml 20 稀释倍数 2 反应时间换算系数 GOT 实际反应时间为 1h 按习惯本法酶活性以 30min 计算〔 4〕故应除以 2 m 植物鲜重 g 26 苯丙氨酸解氨酶的活性测定王艳丽 一原理 苯丙氨 酸解氨酶 Lphenylalanineammonia lyase简称 PAL5催化 L苯丙氨酸裂解为反式肉桂酸和氨反式肉桂酸在 290nm 处有最大吸收值若酶的加入量适当 A290升高的速率可在几小时内保持不变通过测定 A290升高的速率以测定 PAL 活力。