性病实验室操作手册

性病实验室操作手册内容摘要：

页 因素影响，结果常不够稳定，不少学者认为，本试验的目的主要是用以指导治疗。 “敏感”提示用所试药物以标准剂量进行治疗时失败的可能性＜ 5%；“耐药”提示临床治疗的失败率＞ 15%；“中等”结果提示病人用标准剂量的被试抗生素治疗，预期失败率为 5%～ 15%，固而在大部分中度敏感的病人，用较高剂量或延长疗程则治愈率仍可＞ 95%。 若对本地区菌株进行系统耐药监测，则应用琼脂稀释法测定每年菌株的 MIC。 琼脂稀释法（ MIC） 【原理】 将待检菌株种于含有不同抗菌药物的琼脂平皿上， 药物浓度 h 细菌生长，药物浓度高时细菌生长被抑制，据此可测出药物对该菌的最小抑菌浓度，依标准判定菌是否为耐药菌株。 【方法】 1． 精确称取纯品抗生素，溶于合适的溶剂中，用蒸馏水稀释后加到培养基中，使培养基中药物的浓度由少到多逐倍递增。 2． 对待检菌作初步鉴定之后挑取符合标准的菌落作纯培养，于 36℃ 二氧化碳烛缸中培养 24h。 3． 用接种环刮下菌苔，用 MH 肉汤制成 1 107/ml 的悬液。 4． 用多头接种器或特制接种环挑取菌液（约 1181。 l ～ 2181。 l ）接种到含不同浓度药物的琼脂平皿上。 同常规法培养，次日判定结果。 【结果】 淋球菌对药 物的敏感度是指淋球菌不生长的药物最高稀释度。 常用 181。 g /ml 或mg/L 表示。 此数值也即该药对此菌的最小抑菌浓度（ MIC）。 世界卫生组织要求监测的药物的敏感度（青霉素、四环素、壮观霉素、头孢三嗪、环丙氟哌酸）。 【注意事项】 1．抗生素应为纯品，应川精密天平称量。 第 16 页 共 111 页 2．在制备抗生素贮存液时所用的溶剂随抗生素种类而异。 3．根据当地耐药水平的浓度范围，选择制备平板中抗生素的含量。 4．含易分解的抗生素 (如青霉素 )的培养基建议在 3 天内用完，其他的可用一周。 5．应用世界卫生组织 A、 B、 C、 D、 E 五株参考菌株作质控。 【临床意义】 琼脂稀释法是目前测定淋球菌对药物的敏感度的最为准确的方法，重复性好 ,结果较为可靠。 所获资料可作为对当地流行菌株耐药测定的依据。 但 MIC 在耐药范围的菌株，其产生机理可不同。 如对青霉素在耐药范围的淋球菌菌株不一定全是 PPNG 菌株。 PPNG 菌株是由质粒介导的产青霉素酶的淋球菌。 此外，还有由染色体突变而产生的耐青霉素菌株，它不产生青霉素酶。 产青霉素酶淋球菌菌株 (PPNG)测定 青霉素琼脂法 【原理】 某些淋球菌菌株获得耐药质粒后产生β 内酰胺酶。 该酶能分解青霉素，使培养基的 pH 值降低，培养基颜色发生改变。 【材料】 配制培养基 (用 3 000ml 烧瓶配制 )：琼脂 30g 加蒸馏水 2020ml，用 1mol/L NaOH 溶液调 pH 值至 ，加入 %酚红溶液 20ml，充分混合后煮沸。 检查琼脂是否充分溶解，冷却到 50℃， pH 值 ，以无菌手续加人青霉素 (600mg)10支 (每支先用 4ml 蒸馏水溶解 )充分混匀后倒平皿，每 65mm 的平皿倒入 13ml。 【方法】 1．将待测菌株培养过夜。 2．用接 种环刮取菌苔涂于青霉素琼脂上，约绿豆大小。 3．盖盖后于 37℃ 孵箱培养 30min，观察结果。 第 17 页 共 111 页 【结果】 产酶菌株分解青霉素产生青霉噻唑酸使培养基 pH 值降低，颜色由红变黄。 【临床意义】 用于检测淋球菌是否为产β 内酰胺酶菌株。 碘量法（β 内酰胺酶测定） 【原理】 β 内酰胺酶能裂解青霉素的β 内酰胺环形成青霉噻唑酸，它与淀粉竞争游离碘 , 破坏了碘和淀粉的蓝色复合物，使 蓝 色变为无色。 【方法】 1．将 青霉素溶于 pH 值 的磷酸盐缓冲液中，使其浓度成 6000μ g/ml。 取 于一小试管中。 2．将培养 18h～ 24h 的菌在含青霉素试管内制成浓厚菌悬液 (109/ml)。 3．在 37℃水浴中放置 30min，不时摇动，使酶能破坏青霉素。 4．加入 1%可溶性淀粉溶液 ，摇动。 5．加入碘液。 6．在 37℃水浴中放置 10min。 观察结果。 【结果】 在 10min 内能使蓝色完全消退的菌株为β 内酰胺酶阳性，不消 褪 者为阴性。 【注意事项】 1．由于青霉素溶液很易分解，因而用于试验的青霉素溶液应新鲜配制。 如试验的工作量大，青霉素溶液配成后可分装于试管中，在低温冰箱 (－ 25℃ )冻存起来。 但即使这样，保存时间也不宜太长。 2．淀粉液最好新鲜配制。 在 100ml,蒸馏水中加入 1g可溶性淀粉，放到开水中水浴直到淀粉溶解。 贮于冰箱不要超过 1 周。 3．碘液如产生沉淀应新配制。 第 18 页 共 111 页 4．试验应按步骤操作，如果碘加得过早，酶反应就会停止，产生假阴性结果。 7． 每次试验最好用已知的阳性菌株和阴性菌株作对照。 第 19 页 共 111 页 第二章 沙眼衣原体实验室检测 沙眼衣原体是引起尿道炎和宫颈炎的重要病原菌。 由于 70%～ 80%的女性和多达 50%的男性常表现为无临床症状的 感染，所以实验室诊断具有重要作用。 未经治疗的患者不仅容易传染性伴，同时易引发男性附睾炎，女性盆腔炎和不育症。 沙眼衣原体细胞培养 【原理】 沙眼衣原体是专性细胞内寄生的微生物，它自身不能产生能量，依赖于宿主细胞提供。 细胞培养为衣原体的生长提供了必要的条件。 选用的细胞为衣原体感染的敏感细胞，使用化学物质或辐射处理细胞，并用离心方法使衣原体接种物易于进入细胞。 在适宜的培养条件下，衣原体可在细胞中形成胞浆内包涵体，特异性或非特异性染色后可在显微镜下观察。 【 材料】 （ 1）细胞培养液：每 1000ml 中含 RPMI1640 ，新生牛血清 10%，庆大霉素 10181。 g /ml，万古霉素 25181。 g /ml，制霉菌素 25U/ml,HEPES10mmol/L,L谷氨酰胺2mmol/L,用碳酸氢钠调节 pH 至 ； （ 2）标本运送液：每 1000ml 细胞培养液另加葡萄糖 ； （ 3）分离培养液：细胞培养液另加放线菌酮，浓度为 1181。 g /ml； （ 4）无钙镁 PBS：每 1000ml双蒸 NaCl ， KCl , ,； （ 5 ） 胰蛋白酶 EDTA 液：每 200ml 无钙镁 PBS 中，加胰蛋白酶,； （ 6） 碘染色液：每 50ml 蒸馏水中，加 KI ， 结晶紫 ， 甲醇 50ml； （ 7）碘甘油封固液：等量碘染色液与甘油混合。 【方法】 1． McCoy 细胞单层的制备：将 McCoy 细胞从液氮中取出，置 37℃水浴中迅速 第 20 页 共 111 页 融化。 将其加入已含有细胞培养液的培养瓶中，待 8h 细胞贴壁后换新鲜培养液。 继续培养 2~3 天，直至细胞融合成单层。 吸去培养液用少量胰蛋白酶溶液清洗单层。 加胰蛋白酶 EDTA 液消化单层，室温中孵育 2~3min，让细胞完全离散，加培养液吹打细胞使之混悬。 计数细胞调整 McCoy 细胞浓度为 1 105/ml，接种于96 孔板中，每孔加入 细胞悬液。 微量板孔中预先放入一直径为 形盖玻片 ,细胞即可在此玻片上生长， 5%CO 36℃培养 48h，使盖玻片上长成细胞单层。 2．标本的接种：将尿道或宫颈标本加标本液震荡混匀，将单层细胞取出吸取培养液，加入标本液。 将已接种标本的微量板在 35℃、 3000g 离心 1h，弃去标本液，每孔加入 分离培养液 ,培养 48h 观察结果 . 3．观察结果： （ 1）碘染色方法：吸去微量板孔中的培养液加 甲醇于培养孔中 ,固定 10min,弃取甲醇加 碘染色液 ,染 15min 后弃去染色液 ,加 1 滴封固液于洁净玻片上 ,将盖玻片从孔中取出 ,细胞面向下 ,放于封固液上显微镜下观察。 （ 2）姬姆萨染色方法：甲醇固定后，加 姬姆萨染色液染 30min，吸去染液用磷酸缓冲液洗片后，取出盖玻片，自然干燥后镜检。 【结果】 碘染色包涵体染成深棕色；姬姆萨染色包涵体染成深 蓝 色。 【 注意事项 】 （ 1） McCoy 细胞浓度应适宜，细胞生长状态好。 （ 2）配置培养基的试剂的 来源、批号、用量及配置方法应保存好以便追溯问题的来源。 （ 3）胎牛血清应符合质量要求。 （ 4）放线菌酮的浓度应事先摸索，浓度大对衣原体的生长有影响。 第 21 页 共 111 页 衣原体抗原检测（快速胶体金法） 【原理】 衣原体脂多糖抗原与胶体金标记的单克隆抗体结合形成复合物，复合物经虹吸作用而移动，在结果窗被含有的单克隆抗衣原休抗体捕获而形成黑色沉淀线。 质控窗含有抗衣原体抗体，无论是否形成抗原抗体复合物，均在质控窗形成衣原体抗体一抗该抗体复合物，黑色沉淀线。 【材料】 1． 抗原提取液 2． 阳性质控物。 3． 阴性质控物。 4． 试验板。 5． 标本采集管。 【方法】 1． 取材：男性：尿道 2~3 厘米处取材。 女性：宫颈管内 l~2 厘米处取材，或尿道取材。 溃疡部位或腹股沟横痃抽吸液。 标本置于运送培养基中， 24h 接种，超过 24h 应置于低温冰箱保存。 2． 标本处理：将拭子置于采集管内，加入提取缓冲液于刻度， 80℃ 水浴 10 min，放置室温冷却至少 5min。 3． 检测：滴加 5 滴标本提取物于试验板的检测窗，静置 15min，读取结果。 【结果】 质 控窗出现一条黑线，表示试验上正常；如无，说明试剂失效。 结果窗出现一条黑线，表明试验阳性 ； 如无，试验阴性。 结果窗出现一弱黑线，表明结果可疑。 【注意事项】 第 22 页 共 111 页 1． 质控试验：阳性和质控物 5 滴于采集管，测定同标本。 2． 该法适合于女性宫颈和男性尿液标本。 用于男性尿道标本，结果解释应慎重。 3． 该法测定阳性，说明存在衣原休，但不能区别微生物的死活，及病人为感染者和带菌者。 4．严格按照要求观察结果，注意鉴别非特异性沉淀线。 【临床意义】 作衣原体诊断的参考。 结果阳性表示病人可能有衣原体感染 ，但需结合临床症状全面考虑。 该方法的敏感性较低，适合于基层实验室使用。 衣原体抗体测定 酶联免疫吸附试验 【原理】 沙眼衣原体属特异性抗原 (LPS)包被酶标板，与血清中衣原体抗体反应后，再通过与酶标抗衣原体抗体结合，形成抗体一抗原一酶标抗体复合物，经底物显色证明衣原体抗体的存在。 【材料】 ①衣原体抗原包被酶标板。 ②血清稀释液。 ③标准校正液。 ④阴性质控液。 ⑤阳性质控液。 ⑥酶标结合物。 ⑦洗涤缓冲液。 ⑧底物。 ⑨终止液。 【方法】 1．血清处理：稀释试验血清、标准校正液和阴阳性质控液 1： 21(10181。 l +200181。 l )，混用。 2．试验：所订试剂和标本测定前恢复至室温 第 23 页 共 111 页 测定孔 阳性对照 阴性对照 标准校正 X2 标本 l00181。 l 阳性对照 l00181。 l 阴性对照 100181。 l 标准校正 l00181。 l 室温孵育 20min，洗板 5 次 酶聚合物 l00181。 l l00181。 l。