生物工程设备第七章动物细胞生物反应器

生物工程设备第七章动物细胞生物反应器内容摘要：

养的要求。 流化床反应器可用于贴壁依赖性细胞和非贴壁依赖性细胞的培养。 另外，流化床反应器放大也比较容易，放 大效应小，已成功地从 放大至 10L，用于培养同种细胞生产单克隆抗体，体积生产率基本一致。 （四）搅拌罐生物反应器 (stirtank bioreactor) 第 9 页 共 22 页 搅拌罐生物反应器基本结构为：一个旋转过滤器、一台用于控制温度、 pH 值、搅拌速度和溶氧 (DO)的数字控制装置 (DCU)和起通气作用的底部环形喷气结构。 基本原理是新鲜培养基分散进入旋转滤器的外部区域，从旋转滤器的中间获得无微载体的收集液。 旋转滤器一般由不锈钢丝网构成，有良好的生物相溶性，易于清洗和消毒，可重复和长期使用。 在搅拌式生物反应器中同样可以培 养悬浮生长的细胞，又能培养贴壁生长的细胞。 它主要的优点是能满足高密度细胞培养的要求。 CelliGen 笼式通气搅拌罐和 20L 双层笼式通气搅拌罐（ CellCul20）已经大规模培养多种细胞。 1999 年，美国人 Zhaoliec 在搅拌式生物反应器中利用重组 CHO 细胞 4B3 生产了纤维蛋白溶酶原激活 . （五）堆积床生物反应器 (packedbed bioreactor) CelligenPlus 堆积床生物反应器的工作原理为：当推进器 (impeller)旋转时，培养基通过推进器的中心空管螺旋式地从罐体底部往上流，然后 从 3 个出口中流出，通过堆积床向下流动至罐体底部，再通过推进器的中心管往上流。 细胞附着在堆积床的聚酯片上，气体从喷射器喷出进入培养基中。 通过调节气体混合物的组成成分，完成对 pH 和 DO 的控制，加入氧气或氮气以满足培养过程中氧气的吸收；当 pH 太高时加入 CO2；空气作为一种填充气体，保持气体进入罐体时流速的稳定。 培养基通过蠕动泵从培养基储存瓶 (mediareservoir)中进入反应器，收集液通过蠕动泵从反应器中流出进入收集瓶。 堆积床有以下特点：贴壁依赖性和悬浮细胞可成功地在堆积床内附着；细胞不接触气液界面，低漩流 和低剪切力，细胞受到的伤害很小；反应器能以分批式或连续 /灌流方式运转，并可维持长时间。 聚酯片提供高的表面积 /体积比率，维持高细胞密度。 国内有人采用美国 NEW BRUNS WICK SCIENTIFIC 公司生产的Ｃ elliＧ en Ｐ lus 堆积床生物反应器，用无血清培养基培养分泌 rhEPO 的工程细胞株ＸＰ 9501，用于大规模生产重组人促红细胞生成素。 （六）一次性生物反器 (disposable bioreactor) 这种生物反应器由预先消毒的、 FDA 认可的、对生物无害的聚乙烯塑料箱组成，箱中部分填充培养基 并接种细胞。 箱中其余部分是空的，培养过程中空气连续通过这里，空气通过完整的过滤器进入箱体。 前后摇动箱体使液气界面产生波动，大大提高了氧气的溶解量，有利于排出 CO2，控制 pH 值，也促使培养液混合均匀，细胞和颗粒不会下沉。 废气通过一个消毒过滤器和止逆阀。 整个生物反应器置于传统的细胞培养用 CO2 培养箱中，便于控制温度和 pH 值，或者在箱体底部加热控制温度。 培养细胞的密度可达到 7 106mL1 和 100L的工作体积 .使用前箱体用γ射线消毒，用后丢弃。 特殊的开孔可进行无菌加样、取样，而不必把生物反应器置于层流罩中。 装置 简单，易于操作，成本低，低剪切力，无空气鼓泡，减低了气泡对细胞的损害。 可用于培养动物细胞和植物细胞，并十分适合生产病毒。 此反应器已成功悬浮培养重组 NS0 细胞生产单克隆抗体；悬浮培养人 293 细胞生产腺病毒(adenovirus)；用昆虫 sf9 细胞生产棒状病毒 (baculovirus)；用微载体 Cytodex3 培养人 393 细胞。 第 10 页 共 22 页 植物细胞培养生物反应器 植物细胞培养是指在离体的条件下，将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中，进行振荡培养，得到分散成游离的细胞，通过继代培养使细胞 增殖，从而获得大量的细胞群体的一种技术。 植物细胞含有人类所需的成分，而传统的方法从植物中提取分离这些成分已很难满足人们的需求。 近年来，利用植物细胞培养来生产有用代谢产物已受到广泛的关注，但是，只有一小部分的产品已成功用于商业化生产，其原因是反应器设计、过程发展以及对反应机理知识的欠缺等工艺上的限制。 植物细胞生长缓慢、需氧低，此外，由于它们体积较大、细胞壁较厚、液泡较大而对剪切敏感。 因此气升式和柱状生物反应器应用较为普遍。 随着植物细胞悬浮培养技术的逐步完善，单细胞培养的成功，各种新型生物反应器的问世，利用植物 细胞培养技术成为大规模生产植物代谢产物的有效途径。 一、植物细胞培养过程 植物细胞培养按照培养对象可分为单倍体细胞培养和原生质体培养；按照培养基可分为固体培养和液体培养；按照培养方式可分为悬浮培养和固定化细胞培养。 单倍体培养 一般是指花药在人工培养基上进行培养，从小孢子（雄性生殖细胞）直接发育成胚状体，然后再长成单倍体植株；也可以通过愈伤组织诱导分化出芽和根，最终长成植株。 原生质体培养 将植物的体细胞（二倍体细胞）经纤维素酶等去掉细胞壁处理后，获得的原生质体（ protoplast）在无菌培养基上生长、分 裂，最终长成植株。 也可以将不同植物的原生质体融合而获得体细胞杂交的植株。 固体培养是在微生物培养基础上发展起来的植物细胞培养的方法。 培养基添加一定比例的琼脂配制，用培养皿、三角烧瓶或试管分装，经高压灭菌冷却凝固后接种经消毒过的外植体，整个过程需无菌操作。 液体培养 也是在微生物培养基础上发展起来的，可分为静止与振荡两种。 静止培养无需任何设备，适合某些原生质体的培养。 振荡培养需要摇床或转床等设备，可使培养物充分混合以利于气体交换。 细胞悬浮培养 是一种使组织培养物分离成单细胞并不断扩增的液体培养技术。 在进行细胞培养时需要提供容易碎裂的愈伤组织进行液体培养。 与微生物培养相似，植物细胞的悬浮培养也包括分批培养、半连续培养（也叫流加培养）、连续培养三种方式。 目前，植物细胞大规模培养主要采用悬浮培养方式，这主要是由于悬浮培养可以增加培养细胞与培养液的接触面，促进营养的吸收；可带走培养物产生的有害代谢产物，避免高浓度积聚对细胞的伤害；可保证良好的混合状态，从而获得良好的气体传递效果；可以借鉴发酵工程的成熟技术，容易放大实现规模化。 固定化细胞培 养 是在微生物和酶的固定化培养基础上发展起来的。 是固体培养的一种，但不是使用固体培养基，而是与固定化酶或固定化微生物细胞培养类似的一种植物细胞培养技术，目前应用最广泛的、能很好保持细胞活性的固定化方法是将细胞包埋于海藻酸盐或卡拉胶中。 具体培养方法将在下一节中介绍。 （一）植物细胞培养基 对植物细胞的生长而言，培养基的组成成分是一个决定性的因素。 植物细胞培养与动物细胞培养相比，其最大的优点是植物细胞能在简单的合成培养基上生长。 其培养基主要由无机盐类、碳源、维生素、植物生长激素、有机氮源、有机酸等组成。 1．无 机盐类 第 11 页 共 22 页 对于不同的培养对象和形式，无机盐的最佳浓度是不相同的。 通常在培养基中至少含有25mmol/L的硝酸盐和钾。 虽然硝酸盐可以单独作为无机氮源，但是加人一点铵盐对细胞生长有利。 如果铵盐单独作为氮源，添加一些琥珀酸或其他三羧酸循环酸效果更好。 对常规的愈伤组织培养和细胞悬浮培养来说，硝酸盐加上铵的浓度可达到 60mmol/L，说明铵可能对某些培养物有重要作用。 镁、钙和硫元素的浓度在ｌ～３ mmol／Ｌ范围较为合适。 所需的钠、磷和氯化物有钙盐、磷酸盐和微量营养物提供。 微量元素包括碘、锰、锌、钼、铜、钴和铁。 2．碳 源和能源 蔗糖或葡萄糖是常规的碳源，而果糖的利用效果较差。 其他糖类均不合适作为单一的碳源。 培养基中蔗糖被迅速分解为葡萄糖和果糖，葡萄糖首先被利用，然后再利用果糖。 大多数植物细胞对蔗糖的需求范围是 2%到 4%。 通常增加培养基中蔗糖的含量，可增加培养细胞的次生代谢产物量。 3．植物生长激素 植物激素是培养基中不可缺少的组成部分，大多数植物细胞培养基中都含有天然的和合成的植物生长激素。 通常激素可分为二类：生长素和细胞分裂素。 生长素能促进细胞分裂，常用的有吲哚乙酸（ IAA）、吲哚丁酸（ IBA）、 2， 4二氯苯氧基乙酸 （ 2， 4Ｄ）和萘乙酸（ NAA）。 前两种不稳定，能被细胞释放的酶降解，而后两种被细胞降解的较慢，对热稳定。 细胞分裂素常用的是 6苄基瞟怜（ 6BA），激动素（ kt）和玉米素（ zeatin）。 将分裂素和生长素一起使用，效果更佳。 使用量在 ~10ｍｇ／Ｌ之间，可根据不同细胞株而异。 4．维生素 在各种维生素中，硫胺素（维生素 B2）可能是必需的，而烟酸和吡哆辛（维生素 B6）对生长有促进作用。 一般在培养基中都加了较多的肌醇，它能促进愈伤组织的生长。 5．有机氮源 通常采用的有机氮源 有水解酪蛋白 、谷氨酰 胺或氨基酸 混合物。 在 细胞初级培养的早期生长阶段 ，有机氮源可促进胚胎发生和多胚性出现。 6．有机酸 在以铵盐作为单一氮源的培养基培养时，加人丙酮酸或者三羧酸循环中间产物如柠檬酸、琥珀酸、苹果酸等，能够保证植物细胞生长，并且耐受钾盐的能力也有所提高。 （二）植物细胞培养基的制备 配制培养基所用的蒸馏水最好是用玻璃容器蒸馏过的去矿质盐的蒸馏水，所用的无机盐、碳源、维生素应该采用高纯度级的药品。 生长激素在使用前需要重结晶提纯，其酒精－水溶液要用吸附法脱色处理。 蛋白水解液最好用酶水解。 对于吲哚乙酸、吲哚丁酸、 2， 4二氯苯氧基 乙酸和萘乙酸这样难溶于水的生长激素类物质，配溶液时可先溶于 95%的酒精中，然后慢慢加人蒸馏水，稍微加热，稀释至所需体积，再调节 pＨ。 由于培养基配比中有些组分量很小，可按培养基配方浓度配成使用浓度的 10倍或者更多倍的母液，分成小瓶后冷冻保存，使用时再稀释到正常浓度。 为了防止在高浓度下培养基组分间相互作用产生沉淀，钙盐、钠铁盐等要单独配制保存，使用时再稀释混合。 维生素每种也是分开配制的。 配制细胞分裂素物质，应先用少量浓度为 1mol/L的盐酸来溶解，然后加蒸馏水至所需量。 在培养基配制过程中可用 ，固体培养基加人琼脂 %～％， 121℃蒸汽灭菌 15~20min。 大多数培养基成分都经得起高温灭菌，对于一些热敏性化合物，如Ｌ谷氨酰胺、植物生长激素等应该用过滤法灭菌，然后再按无菌操作加人到己灭茵的培养基中。 二、植物细胞培养生物反应器 第 12 页 共 22 页 与天然栽培法相比，利用植物细胞培养技术生产药用代谢产物、食品添加剂、化妆品等具有明显的优势，但能成功地把摇瓶培养的结果放大到生物反应器中而实现大规模培养的较少，可见研究合适的生物反应器对于植物细胞大规模培养生产有用代 谢产物是非常重要的。 植物细胞培养反应器最初大多采用微生物反应器。 由于植物细胞与微生物细胞形态结构不同，植物细胞较微生物细胞大，对氧需求小，对剪切力却很敏感，因此不象微生物培养那样采用高剪切的搅拌，而混合显得更重要。 目前，由于植物细胞悬浮技术的发展，单细胞培养的成功，加上各种新型生物反应器的问世，使得植物细胞有可能像微生物那样在发酵罐中大规模连续培养。 用于植物细胞培养的反应器主要有搅拌式、非搅拌式及其它新型生物反应器，另外还有植物细胞固定化反应器和膜反应器等。 （一）机械搅拌式生物反应器 机械搅拌式生物反应器 混合程度高，适应性广，能获得很高的溶氧系数 KLa，在大规模生产中广泛使用。 但是搅拌罐中产生的剪切力大，容易损伤细胞，且植物细胞培养一般只需较低的溶氧系数。 因而对于有些对剪切力敏感的细胞，传统的机械搅拌罐并不适用。 为此，对搅拌罐进行了改进，包括改变搅拌形式、叶轮结构与类型、空气分布器等，力求减少产生的剪切力，同时满足供氧与混合的要求。 Kaman 等采用带有 1 个双螺旋带状叶轮(helicalribbonimpeller)和 3 个表面挡板的搅拌罐，证明适于剪切力敏感的高密度细胞培养。 Jolicoeur 等进行了类似的研 究，在反应器中得到与摇瓶相同的高浓度生物量。 钟建江等通过培养紫苏细胞进行比较，发现带以微孔金属丝网作为空气分布器的三叶螺旋桨反应器 (MRP)能提供较小的剪切力和良好的供氧及混合状态，优于六平叶涡轮桨反应器，并认为在高浓度细 胞 培 养 时 ， MRP 型 反 应 器 将 显 示 更 大 的 优 越 性。 离 心 式 叶 轮 反 应 器(centrifugalimpellerbioreactor)与细胞升式反应器 (cellliftbioreactor)相比具有较高升液能力，较低剪切力，较短混合时间，在高浓度下具有高得多的溶解氧系数，表明有用于剪切力敏感的生 物系统的巨大潜力。 另有方框型桨式搅拌、蝶型涡轮搅拌等不同形式的机械搅拌罐用于植物细胞培养的生产和研究，结果证明不同叶轮产生剪切力大小顺序为涡轮状叶轮 平叶轮 螺旋状叶轮。 一种升流式生物反应器 (lifts。