生化分离技术标准教案

生化分离技术标准教案内容摘要：

性能以及与溶质、溶剂的性质有关。 通常遵循以下规律： （ 1）非极性吸附剂可从极性溶剂中吸附非极性溶质； （ 2）极性吸附剂可从非极性溶剂中吸附极性物质； （ 3）中等极性吸附剂兼有以上两种能力 四、吸附等温线 概念：当温度一定时，吸附量与浓度之间的函数关系称为吸附等温线。 Langmuir 吸附等温线 qo 和 K 是经验常数， c 代表溶液中溶质浓度 蛋 白质分离提纯时适合此吸附方程 四、影响吸附的主要因素 吸附剂的性质：比表面积、粒度大小、极性 … 吸附质的性质：对表面张力的影响，溶解度，极性，相对分子量 … 温度：吸附是放热过程，吸附质的稳定性 溶液 pH 值：影响吸附质的解离 盐浓度：影响复杂，要视具体情况而定 五、亲和吸附 亲和吸附分离是利用溶质和吸附剂之间特殊的化学作用，从而实现分离。 吸附剂由载体和配位体组成 cK cqq  0 亲和吸附的特点 （ a）效率高：利用亲和吸附可以从粗提液中一次性分离得到高纯度的活性物质。 （ b）分离精度高：可用于分离 含量极低，结构相近的化合物 （ c）但通用性较差，洗脱条件苛刻 影响亲和吸附的因素 （ 1）配基浓度 配基浓度高有利； （ 2）空间位阻 加入 “手臂链 ”以降低空间位阻的影响； （ 3）配基与载体的结合位点 就蛋白质等大分子作为配基时，与载体连接的键越少越好； （ 4）载体孔径：孔道大小； （ 5）微环境：载体或 “手臂链 ”的极性、电性； 六、离子交换 (ion exchange) 概念：利用离子交换树脂作为吸附剂，将溶液中的待分离组分，依据其电荷差异，依靠库仑力吸附在树脂上，然后利用合适的洗脱剂将吸附质从树脂上 洗脱下来，达到分离的目的。 离子交换树脂的构成 （ 1）具有三维空间离体结构的网络骨架 （ 2）联接在骨架上的活性基团 （ 3）活性基团所带的相反电荷的活性离子（可交换离子） 离子交换的分类 按活性基团分类，可分为阳离子交换树脂 (cation exchange)（含酸性基团）和阴离子交换树脂 (anion exchange)（含碱性基团）。 具体又可以分为：强阳、弱阳和强阴、弱阴 常用的离子交换树脂 （ 1）强酸性阳离子交换树脂：活性基团是 SO3H（磺酸基）和CH2SO3H（次甲基磺酸基）； （ 2） 弱酸性阳离子交换树脂：活性基团有 COOH，OCH2COOH， C6H5OH 等弱酸性基团； （ 3）强碱性阴离子交换树脂：活性基团为季铵基团，如三甲胺基或二甲基 223。 羟基乙基胺基； （ 4）弱碱性阴离子交换树脂：活性基团为伯胺或仲胺，碱性较弱； 新型离子交换树脂 （ 1）大孔离子交换树脂 大孔离子交换树脂具有和大孔吸附剂相同的骨架结构，在大孔吸附剂合成后（加入致孔剂），再引入化学功能基团，便可得到大孔离子交换树脂。 （ 2）多糖基离子交换树脂 固相载体为多糖类物质，亲水性强、交换空间大、对生物大分子物致变性作用 主要的多糖基离子交换树脂 （ a）离子交换纤维素 树脂骨架为纤维素，根据活性基团的性质可分为阳离子交换纤维素和阴离子交换纤维素两类。 特点：骨架松散、亲水性强、表面积大、交换容量大、吸附力弱、交换和洗脱条件温和、分辨率高 常用的离子交换纤维素有： 甲基磺酸纤维素、羧甲基纤维素（ CMC）、二乙基氨基乙基纤维素（ DEAE） （ b）葡聚糖凝胶离子交换树脂 骨架为葡聚糖凝胶，如 sepharose、 sephadex，根据功能基团的不同，亦可分为阳离子交换和阴离子交换树脂 命名方法：交换活性基团 +骨架 +原骨架编号 特点 ：除了具有离子交换功能以外，兼有分子筛的功能，提高了分离的效率 常用的葡聚糖凝胶离子交换树脂： CMsephadex C2 DEAEsephadex A25 等 离子交换树脂的理化性能 （ 1）外观：球形、浅色为宜，粒度大小为 16~60 目 90%； （ 2）机械强度： 90%； （ 3）含水量： ~； （ 4）交换容量：重量交换容量、体积交换容量、工作交换容量或称表观交换容量（在某一条件下）； （ 5）稳定性：化学稳定性、热稳定性； （ 6）膨胀度：交联度、活性基团的性 质与数量、活性离子的性质、介质的性质和浓度、骨架结构； （ 7）湿真密度：单位体积湿树脂的重量； （ 8）孔度、孔径、比表面积 离子交换机理 影响交换速度的因素 （ 1）颗粒大小：愈小越快 （ 2）交联度：交联度小，交换速度快 （ 3）温度：越高越快 （ 4）离子化合价：化合价与高，交换越快 （ 5）离子大小：越小越快 （ 6）搅拌速度：在一定程度上，越大越快 （ 7）溶液浓度：当交换速度为外扩散控制时， 浓度越大，交换速度越快 离子交换的选择性 离子交换常数：交换势或交换系数 影响离子交换选择性的因素 （ 1）水合离子半径：半径越小，亲和力越大； （ 2）离子化合价：高价离子易于被吸附； （ 3）溶液 pH：影响交换基团和交换离子的解离程度，但不影响交换容量； （ 4）离子强度：越低越好； （ 5）有机溶剂：不利于吸附； （ 6）交联度、膨胀度、分子筛：交联度大，膨胀度小，筛分能力增大；交联度小，膨胀度大，吸附量减少； （ 7）树脂与粒子间的辅助力：除静电力以外，还有氢键和范德华力等辅助力； 1离子交换操作方法 （ 1） 树脂预处理 物理处理：水洗、过筛，去杂，以获得粒度均匀的树脂颗粒 ； 化学处理：转型（氢型或钠型） 阳离子树脂 酸 —碱 —酸 阴离子树脂 碱 —酸 —碱 最后以去离子水或缓冲液平衡 （ 2） 离子交换吸附 静态：操作简单、但是分批操作，交换不完全 动态：离子交换柱，操作连续、交换完全，适宜多组份分离 柱式固定床 （ 3） 洗脱 离子交换完成后，将树脂吸附的物质重新转入溶液的方法 洗脱方法 A+自溶液中扩散到树脂表面 A+从树脂表面进入树脂内部的活性中心 A+与 RB在活性中心上发生复 分解反应 解吸附离子 B+自树脂内部扩散至树脂表面 B+离子从树脂表面扩散到溶液中 交换速度的控制步骤是扩散速度，不同的分离体系可能由内部扩散或外部扩散控制 ssBA BAR ABRK ]][[ ]][[  （ a）改变溶液 pH 值 （ b）改变溶液离子强度 （ 4）再生 是指是离子交换树脂重新具有交换能力的过程 酸性阳离子树脂 酸 碱 酸 缓冲溶液淋洗 碱性阴离子树脂 碱 酸 碱 缓冲溶液淋洗 方式有：顺流再生和逆流再生 七、离子交换应用实例（离子交换法提取蛋白质） 蛋白质的结构特点 （ 1） 多肽链 （ 2） 电荷分布不均匀 （ 3） 疏水性 （ 4） 不同的蛋白质具有不同的表面电荷分布 pH 值对蛋白质荷电情况的影响 蛋白质的滴定曲线 不同的蛋白质由于其氨基酸组成的差异，具有不同的等电点（ pI），当溶液（环境） pH 值低于其 pI 时，蛋白质带正电荷，而当环境 pH 值高于其等电点时，蛋白质带负电荷，且偏离等电点越多，其所带电荷越多； 缓冲液 pH 的选择 离子交换是依据不同蛋白质荷电性质以及大小差异进行分离的，因此缓冲液的选择将直接影响蛋白质的荷电情况，对于分离的选择性具有重要影响。 离子交换分离蛋白质的基本步骤 蛋白质的离子交换分离同样要经过：平衡、吸附、洗脱和再生四个阶段，具体过程如下图所示： 本章作业 P223 第一题，第二题 影响吸附的主要因素。 亲和吸附的原理和特点是什么。 常用的离子交换 树脂类型有哪些。 影响离子交换速度的因素有哪些。 用于蛋白质提取分离的离子交换剂有哪些哪些特殊要求，主要有哪几类。 教学后记 理论课讲授与实验相结合。 生化分离技术 生化系生物学教研室 授课内容 第七讲 色谱技术 授课时间 2 学时 教学目的 通过本章学习应掌握的问题 什么是色谱分离技术。 色谱分离技术的分类。 什么是色谱柱的理论塔板数以及如何计算理论塔板数。 什么是吸附色谱及其分类和基本原理。 什么是分配色谱。 离子交换色谱的分类及应用 凝胶色谱的分离原理及分 类 离子交换及疏水作用层析的原理 高效液相色谱的分离原理及应用。 蛋白质分离的常用色谱方法有哪些。 教学重点 色谱分离技术 高效液相色谱的分离原理及应用 教学课型 新授 教学方法 讲授法 一、 什么是色谱技术（ Chromatography） 概念：色谱技术是一组相关分离方法的总称，色谱柱的一般结构含有固定相（多孔介质）和流动相，根据物质在两相间的分配行为不同（由于亲和力差异），经过多次分配（吸附 解吸 吸附 解吸 … ），达到分离的目的。 简单的说，色谱技术是在特定的色谱柱当中，利用不同物质与固定相的亲和力差异而实现分离的一组技术。 其优点是分辨率高，是生化产品纯化、分析的重要手段，这一切均源于其特殊的分离模式，即塔板理论 二、色谱分离方法的分类 色谱分离方法很多，种类有四、五十种。 但常用于生物大分子分离的色谱方法，按机理分，有以下几种： 吸附色谱 分配色谱 离子交换色谱 凝胶色谱 三、色谱分离的基本概念 分配系数：可由 Langmuir 方程得出 Kd分配系数 q、 c溶质在固相和液相中的浓度 保留时间（ tR）和保留体积（ VR）：反应样品在柱子中的保留或阻滞能力 ，是色谱过程的基本热力学参数之一 柱的理论塔板数、塔板高度 反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与柱高之间的关系 理论塔板数的计算方法： cqKd N理论塔板数 tR保留时间 W1/2半峰宽 Wb峰底宽度 理论塔板高度： L柱长 四、吸附色谱 原理：利用溶质与吸附剂之间的分子吸附力 (范德华力，包括色散力、诱导力、定向力以及氢键 )的差异而实现分离 关键要素：吸附剂（固定相）和展开剂（流动相）的选择 吸附剂：氧化铝、硅胶、聚酰胺等，均 含有不饱和的氧原子或氮原子以及能够形成氢键的基团，如 OH 和 NH2 常用的吸附剂： 氧化铝、硅胶、活性炭、纤维素、聚酰胺、硅藻土 展开剂的选择 展开剂极性越大，对同一化合物的洗脱能力越大 因此，可以根据实验结果调整展开剂的极性以获得最佳的分离的效果 展开剂选择的原则： （ 1）对被分离组分应具有一定的解吸附能力，极性应比被分离物质的极性略小 （ 2）展开剂应对被分离物质具有一定的溶解能力 吸附色谱的操作程序 （ 1）根据要分离组分的性质（包括极性、分子量、分子结构）选择合适的固定相和流动相 （ 2）吸 附操作：选择合适的操作条件（温度、 pH 值、流速），进行装柱、平衡、上样，测定穿透样品含量以调整操作参数 （ 3）洗脱：采用有机溶剂洗涤、调节 pH 值以及体系离子强度，最大限度地回收目标产物 五、分配色谱 原理：利用溶质在固定相和流动相之间的分配系数不同而分离的方法 构成要素：固定相、载体、流动相 载体 ：通常为惰性材料，能吸附固定相液体 载体种类： 硅胶 、硅藻土、纤维素、葡聚糖凝胶 固定相： 通常选取各组分溶解度大的 溶剂 作为固定相 流动相 可以是极性的（反相色谱法），也可以是非极性的（正相色谱） *反相色谱 固定相是非极性的流动相是极性的 HPLC（ High Performance Liquid Chromatography） 22/1 )( WtN R 2)(16bRWtN NLH 是一种典型的分配色谱，它是基于化合物在固定相和流动相之间分配系数的差异而实现分离的，由于经过了多次的吸附－解析－吸附的过程，其理论塔板数可高达数万（分析性 HPLC） 反相液相色谱 反相液相色谱分离多肽和蛋白质使基于蛋白质的疏水性，因此通常采用非极性的烷基固定相作为填料，其表面化学性质和流动相的选择应最大限度地满足疏水的要求 载体：微粒多孔硅胶（粒径 5μ m~20μ m ） Hypersil Spherosil XOB075 固定相： C1 C8 烷基链， C8 适于分离蛋白质 C18 适于分离核酸 苯基 流动相的选择 通常采用有机溶剂，。