检验科微生物室sop文件检验科微生物实验室

检验科微生物室sop文件检验科微生物实验室内容摘要：

一次，冷却后再划下一区域，每一区域的划线均接触上一区域的接种线 1―2 次，使菌量逐渐减少以获得单个菌落。 快速划线分离法：采用快速划线使一接种环标本能分离出单个菌落，这与标本的菌量及操作者的技能有很大关系。 ，所用平板大小可根据需要的菌量而定。 方法是将一单个菌落或将相同的菌落作大量密集涂划于平板上而获得大量纯的培养物。 作业指导书 显微镜检查 法 文件编号： LAB－ SOP－ JX022 显微镜检查法 显微镜检查是细菌鉴定工作中的一重要手段，有助于细菌的初步鉴别，同时对下一步鉴定工作起着重要的指导作用。 有时通过形态学检查可得到初步诊断，如痰中的抗酸杆菌和泌尿生殖道分泌物中的淋病奈瑟菌等。 显微镜检查有不染色标本检查法和染色标本检查法两种。 1. 不染色标本的检查：不染色标本主要用于检查细菌的动力及运动状况。 压滴法：用接种环取细菌悬液 2 环，置于清洁载玻片中央，覆上盖玻片，于高倍镜下观察。 制片时菌液要适量，不可有气泡，不可外溢。 悬滴法： 取洁净的凹窝载玻片及盖玻片各 1 块，将凹孔四周的平面上涂上一层凡士林，取一环菌液置盖玻片中央，将凹窝载玻片的凹面向下，对准于盖玻片的液滴上，然后迅速翻转玻片，用小镊子轻压盖玻片使之与凹孔边缘粘紧。 镜下观察时先低倍后高倍，不可压碎盖玻片。 有动力的细菌可见细菌从一处移到另一处，无动力的细菌呈布朗运动而无位置的改变。 螺旋体由于菌体纤细、透明，需用暗视野显微镜观察其形态、活动。 2. 染色标本检查法：通过对标本的制片及染色，能观察细菌的形态、大小、排列、染色特性以及荚膜、芽胞、异染颗粒等结构，有助于细菌的初步鉴定。 快速革兰染色法 结果：革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。 注意事项：染色关健在于涂片和脱色，涂片不宜过厚，固定不宜过热，脱色不宜过度，菌龄为 18～ 24 小时为佳。 抗酸染色法 操作见试剂说明书 结果：抗酸杆菌呈红色。 注意事项：每一张玻片只能涂一份标本且不能在染色缸中染色，以免造成不同标本间的交互污染从而导致阴阳性结果混淆，脱色时间宁长勿短，至无红色液体流下为止。 阿尔培异染颗粒染色法： 初染：涂片上滴加第一液染剂（甲苯胺蓝 和孔雀绿的乙醇溶液），染 35 分钟，水洗。 复染：第二液染剂（碘化钾溶液）染 1 分钟，水洗。 自然干燥后镜检。 结果：菌体呈绿色，异染颗粒呈蓝黑色。 注意事项：玻片要清洁，染料需新鲜配制，无沉淀物。 注意与标本中的其他杂质相区别。 ，主要观察细菌在组织中的分布。 ：背景着色而菌体不着色的染色法，用以观察新型隐球菌的宽厚荚膜等。 ，观察细菌有否鞭毛、鞭毛的位置、鞭毛的数量，在非发酵菌的鉴定中是一项重要的指标。 ：观察一些较微小且 有一定结构的微生物，如钩端螺旋体的钩状及螺旋的形态等。 ，在标本加入抗血清，观察动力是否被抑制，如霍乱弧菌的制动试验等。 ，用标有荧光素的物质与检材中的微生物特异结合产生荧光的特点而对微生物作出鉴定。 作业指导书 穿刺液标本的 细菌学检验 文件编号： LAB－ SOP－ JX023 穿刺液标本的细菌学检验 1. 标本采集 穿刺液包括胸水、腹水、心包液、关节液及鞘膜液等。 一般由临床医师以无菌操作穿刺术抽取。 胸腹水抽取 5～ 10 毫升，心包液、关节液等可抽取 2～ 5m1，将所取得之样本注入含有抗凝剂的无菌管内充分混匀后送检。 标本采集最好能在停药 2 天后进行，如不能停药，则应在下次用药前采集，如疑为淋病性关节炎患者，其标本应在采集后立即送检或床边直接接种，切不可放冰箱保存。 2. 检验步骤 涂片检查 标本 3000r/min 离心 l5 分钟后，取沉淀物制片。 涂片镜检的细菌常为一般致病菌、革兰氏阴性双球菌和抗酸杆菌等，涂片检查应根据项目要求进行相应的染色镜检。 培养：作一般细菌培养可把采集的标本接种于血平板、麦康凯、巧克力平板，同时也可将标 本注入血培养瓶放入血培养仪培养。 作厌氧培养可采用直接床边接种标本或采集样本后，将培养物直接注入厌氧增菌培养基。 3. 操作流程 穿刺液 厌氧 涂片革兰氏染色 需氧 注入血培养瓶 厌氧平板 血平板 放入血培养仪 厌氧肉汤 初步报告 麦康凯 阳性报警 巧克力 分离培养 菌落观察 涂片染色 Vitek32 鉴定、药敏 /BD 凤凰鉴定、药敏 确定报告 4. 报告结果 涂片报告发现形似某某细菌，淋球菌应报是否在细胞内外发现革兰氏阴性双球菌；抗酸染色应报是否发现抗酸杆菌。 用于培养的穿刺液 正常情况下应无菌，如培养出细菌应报细菌种名及药敏试验结果，血培养仪培养 6 天仍未发现细菌则报无菌生长。 检验科 作业指导书 胆汁标本的细菌学检验 文件编号： LAB－ SOP－ JX024 胆汁标本的细菌学检验 胆汁培养常见病原菌 革兰阳性菌 革兰阴性菌 肠球菌 大肠埃希菌 葡萄球菌 变形杆菌消化链球菌 肺炎克雷伯氏菌产气肠杆菌铜绿假单胞菌伤寒及其它沙门菌拟杆菌粪产硷杆菌 胆汁标本的采集方法有三种，即十二指肠引流法，胆囊穿刺法及手术直接采取法。 十二指肠引流法：在无菌操作下用导 管作十二指肠引流胆汁，分为 A、 B、 C 三部分。 A液来自胆管，为橙黄或金黄； B 液来自胆囊，为棕黄绿色； C 液来自肝胆道，为柠檬色。 一般认为 B 液做细菌培养意义较大。 胆囊穿刺法：进行胆囊造影时同时采取胆汁。 本法所采取的胆汁不易被污染，适宜做细菌培养。 手术采取法：在进行胆部外科手术时直接采取胆汁送检。 将送检标本 3000r/min 离心 30 分钟，倾去上清液 取沉淀物涂片及培养。 胆汁一般不作涂片检验，如需要应用相应的染色方法检查并仔细观察，因为胆汁沉淀后有较多的内容物复盖而不利于观察细菌。 培养提倡直接将胆汁注入血培养瓶进行增菌培养。 培养标本也可直接种血平板、麦康凯平板和巧克力平板。 胆汁 需氧 血培养瓶增菌 涂片染色 血平板、巧克力平板 血平板、巧克力平板 初步报告 麦康凯 菌落观察 涂片染色 Vitek32 鉴定、药敏 /BD 凤凰鉴定、药敏 确定报告 检验科 作业指导书 胆汁标本的细菌学检验 文件编号： LAB－ OP－ XJ024 沙门氏菌感染在胆汁中检出率较高，但必须以血清凝集试验为依据报告血清型。 胆汁应是无菌的，如培养出细菌即为致病菌应报细菌的种属及药敏试验结果。 检验科 作业指导书 粪便标本的细菌学检验 文件编号： LAB－ SOP－ JX025 粪便标本的细菌学检验 革兰阳性菌 革兰阴性菌 金黄色葡萄球菌 伤寒及其它沙门菌 结核分支杆菌 志贺菌属 难辨梭菌 致病大肠埃希菌 白色念珠菌 （ ETEC、 EPEC、 EIEC、 EHEC） 弧菌属菌种 气单胞、邻单胞菌种 小肠结肠炎耶尔森 菌 弯曲菌 自然排便采集法 自然排便后，挑取脓血、粘膜部分的粪便 2～ 3g，液体粪便取絮状物置于大便培养管或增菌液中送检。 直肠肛管法 用大便培养用的肛管直接插入肛门成人 4～ 5cm，幼儿 2～ 3cm，轻轻在直肠内旋转数次，目的是使直肠表面粘液能通过肛管孔进入肛管内。 然后拔出放入大便培养管中送检。 涂片检查 粪便标本因各种正常菌群含量甚多而一般不作直接涂片找致病菌，只有怀疑霍乱弧菌及菌群失调所致腹泻时，才作直接涂片检查。 各项的涂片检验均按染色方法进行， 但大便检查霍乱弧菌有其处理程序： 染色检查：将米泔样的标本涂 2 张片用乙醇固定后染色，目的观察弧菌有无呈鱼群状排列。 悬滴检查 取患者粪便制成悬滴涂片，霍乱弧菌和 EI tor 弧菌均呈现极活泼的穿梭状运动。 制动检验 运动活泼的弧菌涂片加人霍乱弧菌诊断血清后，在显微镜下观察，若原运动活泼的现象停止，为制动试验阳性。 大便标本的培养目的是培养致病菌或追踪病人有否菌群失调现象，无特殊要求作一般致病菌培养的标本接种麦康凯、 SS 平板各一个。 菌群失调的细菌学检验：选用多种培养 基包括 SS、麦康凯、血平板、高盐甘露醇盐琼脂平板、 CampyBA 血琼脂平板和沙氏琼脂等，目的是使更多的菌群得到生长，以利于检查肠道的细菌情况。 霍乱弧菌的培养，直接取患者米泔样粪便 ，接种于碱性蛋白胨水增菌液和 4 号平板， 35℃ 培养 6～ 8h，再转种一只 4 号平板。 35℃ 培养 18～ 24h 后形成较大、菌落中间为灰黑色、有光泽、隆起、湿润的菌落，如泼水状。 挑取可疑菌落 5～ 10 个与霍乱多价 “O” 诊断血清作玻片凝集试验，如为阳性，则立即报告，并将可疑菌送成都市疾病控制中心确认。 作结核菌培养应先处理 (参照杂菌处理方法篇章介绍 )后种入改良罗氏培养基中或 magot培养基。 厌氧性难辨梭菌的培养参照厌氧培养。 真菌培养：真菌性腹泻多继发于抗生素治疗后，常见的真菌腹泻多由白色假丝酵母菌引起。 将标本接种于沙氏平板及血平板上，置 27℃ 和 35℃ 培养 18～ 24h，根据形态染色、菌落特征或采用 VITEK32 YBC 或 API Aux 半自动条鉴定，并做 ATB Fungus 药敏试验。 作业指导书 粪便标本的细菌学检验 文件编号： LAB－ SOP－ JX025 粪便或肛拭子 增菌培养 分离培养 涂片检查 沙门氏菌、志贺氏菌 35℃18 ～ 24h 霍乱弧菌 SS、麦康凯平板 革兰氏染色 观察动力 沙氏斜面、 血平板等 菌落观察 涂片检查 血清学鉴定 Vitek32 鉴定、药敏 /BD 凤凰鉴定、药敏 确定报告 ：查出肠道致病菌，报告其菌名和药敏结果。 如为致病性大肠埃希菌必须以血清学诊断试验为鉴定依据，报告应包括 ETEC、 EPEC、 EIEC、 EHEC。 、沙门氏菌、志贺氏菌、致病性大肠杆菌时应作为危急值报告，并填写几危急值报告单。 作业指导书 血液及骨 髓标本 的细菌学检验 文件编号： LAB－ SOP－ JX026 血液及骨髓标本的细菌学检验 血液及骨髓标本中常见病原菌 革兰阳性菌 革兰阴性菌 肺炎链球菌 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 伤寒及其它沙门菌 表皮葡萄球菌 变形杆菌 溶血性链球菌 产气肠杆菌 粪肠球菌 肺炎克雷伯氏菌 铜绿假单胞菌 粪产硷杆菌 沙雷氏菌 流感嗜血杆菌 布鲁氏菌 采血时间：在病人发热初期 12 天内或发热高峰时采集血液标本。 采血时间原则上应选择在抗菌药物应用前 ,对已用药而又不能中止用药的病人，应在下次 用药前采集。 标本采集方法及标本量 成人每次采血 10ml，婴幼儿每次采血 15ml。 严格无菌采集的血液标本应立即加入血培养瓶内，迅速轻摇，使之充分混合，以防血液凝固。 对于疑为细菌性骨髓炎病人，应在严格消毒后抽取骨髓 1ml 然后注入小儿瓶中进行增菌培养。 血液 无菌注入 血培养瓶 6 天无菌生长 增菌培养 血平板 阳性报警 巧克力平板 无菌生长 发阴性报告 涂片染色 血平板 初步报告 巧克力平板（ 5%CO2 条件） 3537℃ ， 1824 小时 菌落观察、涂片染色及相关酶试验 Vitek32 鉴定、药敏 /BD 凤凰鉴定、药敏 确定报告 作业指导书 血液及骨髓标本 的细菌学检验 文件编号： LAB－ OP－ XJ026 4. 报告结果 在血液中检出沙门氏菌，必须以血清凝集试验为依据报告血清型。 血液正常情况下应是无菌的，如培养出细菌即为致病菌，应报细菌的种属及药敏试验结果。 血培养阳性均作为危急值报告，并填写危急值报告单。 作业指导书 脑脊液的细菌学检验 文件编号： LAB－ OP－ XJ027 脑脊液的细菌学检验 脑脊液培养常见病原菌 革兰阳性菌 革兰阴性菌 金黄色葡萄球菌 脑膜炎奈瑟菌 A、 B 群链球菌 卡他布兰汉菌 肺炎链球菌 流感嗜血杆菌 结核分支杆菌 肠杆菌科菌种 产单核李斯特菌 脑膜败血性黄杆菌 新型隐球菌 假单胞菌 白色念珠菌 ： 标本必须由临床医师以无菌操作收集脑脊液 3～ 5ml，盛于无菌管中送检。 脑脊液中某些细菌（脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌和流感嗜血杆菌等）易死亡，故收集标本后应立即送检。 切不可低温（冰箱）保存。 ： 一般细菌涂片检查 除结核性脑膜炎外，由其它细菌引起的化脓性脑膜炎，脑脊液明显混浊，可直接涂片，革兰染色镜检。 无色 透明的脑脊液，应离心后涂片、染色、镜检，根据。