常见的免疫学实验技术

常见的免疫学实验技术内容摘要：

前者无凝集而与后者有凝集，则表示伤寒杆菌免疫血清中的抗肠炎抗体已被完全吸收。 实验四 溶血反应和补体结合试验 一．溶血反应 免疫血清与其相应的抗原细胞 (血球、细菌 及其组织细胞相遇，并在补体的参与下可出现溶细胞反应。 依抗原、抗体的种类不同可有溶血反应、溶菌反应等。 溶菌反应只在某些细菌中出现 (如霍乱弧菌 )。 应用溶血反应是补体结合反应中不可少的因素。 溶血反应是由于抗原 (红血球 )和抗体 (溶血素 )进行特异性的结合，并吸着了补体，而使红血球在补体的作用下被溶解，于是产生了溶血现象。 材料： 1. 抗原： 2%绵羊红血球。 2. 抗体：溶血素 3. 补体：取健康豚鼠血清作为补体。 4. 小试管、生理盐水、水浴箱。 方法： 1．取小试管 3 只，按下表加入各物 (容量单位为毫升 ) 试管 2%红血球溶血素 (2 单位 )补体 (2 单位 )生理盐水结果 —— —— 2．将上述 3 试管放在 37℃水浴箱内 15— 30 分钟观察有无凝血现象。 二．补体结合反应 当抗原与其对应的抗体结合时，所生成的抗原抗体复合物能从溶液中将补体吸着此即谓补体结合。 参与补体结合反应的抗原是透明的溶液，故补体结合现象不能被肉眼看 出来，因此必须借助溶血系统 (溶血素及相对应的羊血球 )作为指示剂，来判定媒质中有无游离的补体，近而推定媒质中未知抗原 (或抗体 )和已知抗体 (或抗原 )是否进行了特异性的结合。 本反应具有很高的敏感性及特异性，因之常应用于传染病的诊断，特别诊断病毒疾病和梅毒。 由于参与本反应的各种成分间有着一定量的关系，因此在作本试验之前，必须通过一系列的预备实验来确定各成分的使用量，故本反应的实验方法较为复杂。 本次实验以伤寒杆菌免疫血清与其相对应的抗原补体结合试验为例。 材料： 1. 抗原：伤寒的抽出液 2. 抗体：伤寒杆菌的免疫血清 3. 补体：豚鼠血清 4. 溶血素：抗绵羊血细胞的兔血清 5. 2%绵羊红血球 6. 小试管、试管架、水浴锅。 方法： (一 )预备试验 (示教说明 ) 预备试验包括溶血素效价的滴定，补体效价的滴定，抗原效价的滴定及被检血清的处理。 (1) 溶血素效价的滴定 按照下表加入各物 管号溶血素 (ml)溶血素 稀释倍数 1： 20 补体 (ml)生理 盐水 (ml)2%羊血球 (ml) 假定结果 ： 摇匀后置 37℃水浴一小时 全溶解 ： 全溶解 ： 全溶解 ： 全溶解 ： 全溶解 ： 全溶解 ： 全溶解 ： 全溶解 ： 全溶解 ： ： ： 对照 凡最高稀释度的溶血素可呈现完全溶血者为一个单位。 依上表结果第10 管 (即 1： 4000 倍稀释 ) 毫升溶血素为一个单位，在溶血反应中常用 毫升中含有 2 个溶血素单位的溶液，所以试验时应取 1： 2020倍稀释的溶液。 (2) 补体单位滴定 依下表加入各试剂： 管 号补体 (1： 20)(ml)抗原 (ml)生理盐水 (ml)置 于 37 ℃ 水 浴 45 分钟溶血素 (2 单位 )(ml)2%羊血球悬液 (ml)置 于 37 ‍℃ 水 浴 15 分钟结果 不溶血 稍溶血 全溶血 全溶血 全溶血 全溶血 全溶血 不溶血 能引起完全溶血的最小补体量称为准确单位，上表中第 3 管 (即 毫升 )，但因补体的效价可能有部分损失，故普通稍高的一管为实用单位，实际试验时须用两个实用单位。 上表的结果为： 补体标准单位： 毫升 补体实用单位： 毫升 补体两个实用单位： 毫升 因试验时是两个实用单位的补体 毫升，可依下列比例关系换算： 20： =ⅹ： ⅹ = 即须将补体稀释 倍，用 毫升则含有两个实用单位。 (3) 抗原的滴定 在用已知抗原测定未知抗体时，必须先滴定抗原效价以决定本试验时所需抗原的最适浓度 (反之用已知抗体测定未知抗原时，则需滴定抗体效价 ) 试 管号 剂 123456 1： 5 稀释血清 －－－ 伤寒抗原 －－ －－ 痢疾抗 原 1： 80－ －－－－ 补体 生理盐水－－ 摇匀放置 37℃水浴中 30min 溶血素 － 2％羊血球 摇匀放置 37℃水浴中 15min 说明试验管特异性对照血清 对照抗原 对照溶血素对照羊血球对照 如血清对照管呈完全或部分不溶血是为抗补体现象。 血清严重污染细菌，混有淋巴液或显著溶血时，常产生很强抗外体作用。 又如试管、吸管不清洁，也可出现抗补体。 若有抗补体发生，应抽血重试验。 实验五 T、 B 淋巴细胞分离试验 淋巴细胞主要分 T 淋巴细胞和 B 淋巴细胞两大亚群，它们具有不同的特性和功能，为此在进行某些免疫学实验时，首先需分离出纯的 T淋巴细胞和 B 淋巴细胞。 本试验的原理为：淋巴细胞与用溴花二氨基异硫氢化物 (简称 AET)处理的绵羊红细胞 (SRBC)混合后，其中全部 T淋巴细胞均能吸附 AET— SRBC，形成牢固稳定而巨大的 E— 花环，较正常未处理的 SRBC 形成的 E— 花环百分比为高，而且形成快速，不易脱落，重复性好。 再经淋巴细胞分层液 分离时， AET— E 花环易沉于管底，而未形成 E— 花环的 T淋巴细胞，用低渗液解花环周围的 AET— SRBC，便可获得纯 T 淋巴细胞，而 B 淋巴细胞可直接取自分层液的界面。 材料及试剂： a) 新鲜豚鼠血 b) 兔红细胞 (RRBC) c) 溴花二氨基异硫氢化物 (AET) d) 淋巴细胞分层液 e) 其它 Hanks 液，含小牛血清的 199 培养液，无菌生理盐水， %氯化钠溶液，离心机等。 方法： 1. AET— RRBC 制备 (1). AET 溶液的制备 称取 AET 粉剂 402 毫克，溶于 10 毫升蒸馏水中，使成为 溶液，用 4N NaOH 溶液调。 该溶液必须新鲜配制，不宜久存。 (2). AET 处理 RRBC 取洗涤好压积的 RRBC，按一份压积 AET— RRBC 加入 4 份新鲜配制的 的 AET溶液充分混匀置 37℃水浴 15 分钟，每隔 5 分钟摇匀一次。 取出加冷无菌生理盐水至离心管口 (1— 2 厘米 )1800 转 /分离心 5分钟。 连续洗涤 3— 5 次，每洗一次，必须充分摇匀，以减少 AET—RRBC 粘附成团，并观察有无溶血。 若有溶血现象，则用含小牛 血清的 199 培养基再洗一次，最后配成 10%AET— RRBC 悬液，置 4℃保存，不得超过 5 天。 (3).1%AET— RRBC 的配制： 将预先配制并保存于 4℃冰箱的 10%浓度的 AET— RRBC，以含 10%小牛血清的 199 培养液稀释至 1%。 2. 从新鲜豚鼠血液分离单个核细胞，操作见后试验。 3. AET— E 花环试验： 将分离的单个核细胞 (2ⅹ 106/毫升 )与等量 1%AET— RRBC 混合，置37℃水浴 15 分钟，每隔 5分钟摇匀一次，分装数管，每管 2— 3 毫升，低速离心 (1000 转 /分钟 )5 分钟后，移至 4℃冰箱 45 分钟。 4. T 淋巴细胞和 B 淋巴细胞的分离 将形成 E— 花环的细胞悬液，再用淋巴细胞分层液分离，吸取界面云雾状的细胞，即为富含 B 淋巴细胞群。 沉淀于管底的 E— 花环，用Hanks 液洗一次后，加双蒸水 3 毫升处理 3 分钟，低渗裂解 E— 花环周围的 RRBC，立即加 %氯化钠溶液 1 毫升，使还原为等渗，低速离心沉淀，即得富含 T 淋巴细胞群。 实验六 豚鼠 T 淋巴细胞的测定 —— 兔红细胞玫瑰花环试验 玫瑰花环试验，又称为花结试验。 是测定淋巴细胞数量和功能的一种方法。 人类 T和 B 淋巴细胞表 面具有不同的受体。 由于人类 T淋巴细胞表面具有与绵羊红细胞结合的受体，能与绵羊红细胞非特异性结合，形成E 花环，因此， T 细胞也成为红细胞花瓣形成细胞。 根据 E— 玫瑰花环形成率，可以间接判断机体细胞免疫力。 目前，已广泛应用于临床，作为测定人群免疫状态的一个指标。 材料： 1. 肝素 (100 单位 /毫升 ) 2. %兔红细胞悬液 (用 Hanks 液配制 ) 3. 吸收过的胎牛血清： 取经 56℃ 30 分钟加热灭活后的胎牛血清加半量压积兔红细胞混合后， 37℃水浴 20 分钟， 2020 转 /分离心 10 分钟，取上 清液即成。 4. Hanks 液 5. 豚鼠抗凝血 6. 淋巴细胞分层液 7. 灭菌注射器，针头，试管，吸管等。 方法： 1. 淋巴细胞提取 (1) 取豚鼠抗凝血 2毫升，加 3毫升 Hanks液使之稀释。 加于 3 毫升淋巴细胞分层液液面之上 (沿管壁轻轻加入，勿使两液相混 )。 (2) 2020 转 /分离心 30 分钟，吸淋巴细胞层到另一试管中加 5 倍体积的 Hanks 液洗 1— 2 次， (1500 转 /分离心 10 分钟 )弃上清即成。 图 8 用分层 液离心后的血细胞层 2. 加吸收过的胎牛血清 毫升， %兔红细胞悬液 毫升，于淋巴细胞中。 混合后， 37℃水浴 5 分钟。 3. 500 转 /分离心 5 分钟，放 4℃冰箱中 2 小时后，弃大部分上清。 4. 染色及观察 轻轻悬浮沉积的细胞。 向悬液中滴一滴美兰液，混合， 10 分钟后取一滴放载玻片上，加盖玻片镜检。 高倍镜或油镜下计数 200 个淋巴细胞，凡结合 3 个或 3 个以上的兔红细胞者为阳性，计算花环形成细胞的百分率。 实验七 酶联免疫吸附试验 (ELISA)测定伤寒杆菌“ O”抗体 酶联免疫吸附试验是用酶标记的抗体 (或 SPA)检测未知抗原或抗体的方法。 此法敏感性高，特异性强。 常用的是 ELISA 方法，间接法，双抗体法和抗原法。 本次试验介绍，酶联葡萄球菌蛋白 A 免疫分析法。 ELISA 法原理如下，见图 9 图 9 ELISA－ SPA 法原理 1. 加抗原 使之吸附于固相载体 (如塑料反应板 ) 2. 洗涤 加待测血清 3. 洗涤 加酶标记 SpA 4. 洗涤 加酶的底物。 经酶的催化产生有色产物。 材料： 1. 聚乙烯塑料反应板 ( 时可吸附蛋白 Ag) 2. 抗原：伤寒杆菌 O901 煮沸或超声波粉碎抗原 3. 待测血清 4. 冻干酶联葡萄球菌 A 蛋白 (HRD— proteinA)纯品 5. 邻苯二胺 (OPD) 6. 包被液： 碳酸钠 — 碳酸氢钠溶液 7. 稀释液： 10%免疫血清 PBS— 吐温 20，防止非特异性吸附 8. 洗涤液： , 防止非特异性吸附 9. 底物溶液： 磷酸氢二钠 毫升 柠檬酸 毫升 蒸馏水 50 毫升 临用前新鲜配制，在上述缓冲液中溶解 40 毫克邻苯二胺，然后加入30%双氧水 毫升，底物对光敏感，需要避光并立即使用。 10. 终止液； 2M 硫酸 方法： 1．抗原包被 取洁净的聚苯乙烯微量反应板，于每孔内加伤寒抗原 毫升 (用包被缓冲液稀释，蛋白含量 10 微克 /毫升 )，置 37℃ 1 小时，弃抗原液，用洗涤液 3 次每次 3 分钟。 2．加待测血清 于每孔内分别加不同稀释度 (如 1： 5， 1： 10， 1： 20„ 1： 80)的待测血清， PBS 空白对照，阴性对照血清，阳性对照血清各 毫升。 置37℃ 30 分钟，洗涤 3 次。 3．加酶联 A 蛋白 于每孔加酶联 A 蛋白各 毫升，置 37℃ 20 分钟，洗涤 3 次。 4．加临时配制的底物溶液各 毫升，置暗处 15 分钟。 加 2M 碳酸1 滴终止反应。 ： (肉眼判断 ) 若颜色于阴性对照相同则为阴性，若较阴性对照深则为阳性，根据颜色深浅以 (+)表示。 综合设计性实验 实验一 抗体产生细胞的检测 ——。