微生物工程教案

微生物工程教案内容摘要：

，多相同，也可不相同。 ②化学修饰调节理论： 变构酶与某 物质共价结合而提高或降低活性。 如：柠檬酸裂解酶的乙酰化。 乙酰 酶 +柠檬酸 柠檬酸 S酶 +乙酸 柠檬酸 S酶 乙酰 酶 +草酰乙酸 三、酶合成的调节 •酶活性调节：细，快； •酶量调节：粗，慢。 酶合成的诱导作用 诱导酶的合成需要诱导剂，它可是底物，也可是底物的结构类似物。 一种酶可有多种诱导剂，其能力与诱导剂的种类和浓度有关。 酶合成的阻遏 •某种代谢物积累除抑制酶活性外，还可反馈阻遏酶合成，降低反应速度。 ①末端产物阻遏： 常普遍存在与氨基酸、核苷 酸生物合成途径中。 ②分解代谢物阻遏： 如： ―葡萄糖效应 ‖。 其代谢物阻遏 ―缓慢利用能源 ‖酶的合成。 酶合成调节的机制 •操纵子模型：在 DNA 分子的不同区段上至少有四种基因，即调节基因 R（编码阻遏物）、操纵基因 O（阻遏物结合、控制结构基因）、启动基因 P（ RNA 聚合酶结合位点）和结构基因 S（转录 mRNA）。 操纵基因、启动基因和结构基因又构成了操纵子。 酶合成调节的机制 ①单一效应物调节： 负调节：调节基因 R 的产物阻止转录进行。 如：大肠杆菌乳糖操纵子； 正调节： R 基因的产物在诱导物存在下，成为转录激活 剂。 如：阿拉伯糖操纵子。 ②两种效应物的共同调节： 乳糖操纵子的效应物（如：乳糖）和活化蛋白 （如： CRP）的调节。 ③弱化调节 大肠杆菌色氨酸合成操纵子的 R、 O、 P 远离 S，除阻遏调节外，有弱化调节方式。 色氨酸存在时，使转录未到终点时， 8090％ 转录停止。 是通过弱化子实现的。 色氨酸贫乏时，核糖体停在 UGG， 3 链配 对，聚合酶过，酶合成 ； 色氨酸充足时，转录至 UGA（ 6971）， 4 链配对，不利于 RNA 聚合酶过，酶不合成。 四、分支生物合成途径的调节 功 酶 调 节：催化相同反应，但酶分子结构有差异； ：一个不能少； ：按比例累加，无协同效应，无拮抗作用； ： 1+1＞ 2； ：按①→②→③顺序逐步抑制； ：途径产物各自调节，同一中间产物 ：一酶两形式，活力有差异，关键在有无共 价连接物（腺苷酰基）。 五、能荷调节 细胞的能荷计算式： [ATP]+1/2[ADP] 能荷 =—————————— [ATP]+ [ADP]+[AMP] 能荷高时， ATP 的酶合成系统受抑制， ATP 消耗酶系统被活化。 呈抑制与活化的中间状态的能荷大约是 ，此时两种酶系统达到平衡。 六、代谢调控 •根据代谢调节理论 ,通过改变发酵工艺 条件 (温度、 PH、风量、培养基组成 )和菌种遗传特性，达到改变菌体内的代谢平衡，过量产生所需产物的目的。 ①各种发酵条件对微生物的影响 同菌种，同培养基，培养条件不同，可获不同代谢产物（途径不同）。 啤酒酵母，用葡萄糖，中性产乙醇，酸性产 CO2，碱性产甘油。 ②使用诱导物 可用底物或底物类似物有效增加诱导酶的产量。 ③添加生物合成的前体 加前体，避开受抑制酶，大量合成终产物。 ④培养 基成分和浓度的控制 速效碳、氮源可能引起分解代谢阻遏。 应与迟效碳、氮源适量搭配。 •培养基中加改变细胞透性物质，利于产物分泌，避免反馈抑制。 如： 15ml/L 生物素控制膜中脂质合成； 青霉素抑制肽聚糖中肽链交联； 土温 80 或阳离子表面活性剂使壁中脂类流出； 控制 Mn2+、 Zn2+浓度干扰膜、壁形成； 筛选透性突变株。 •营养缺陷型突变株； 如：利用谷氨酸棒状杆菌营养缺陷型（转 氨甲酰酶缺陷）突变株生产鸟氨酸。 •抗反馈调节突变株； •组成型突变株； •抗性突变株。 七、次级代谢与次级代谢调节 •主要包括：抗生素、刺激素、生物碱、 维生素、色素、毒素等。 初级代谢：与生物生存有关的，涉及能量产生和能量消 耗的代谢类型。 生存必需；始终产；不同种，相同；环境敏感性小； 酶专一。 次级代谢：某些生物为避免某种代谢物积累造成不利作 用而产生的一类有利生存的代谢。 并非必需，但有一定价值；某一时产；不同种，不同； 受环境敏影响大；酶专一性不强。 ①酶合成的诱导调节 有些酶也是诱导酶，以底物或底物类似物（内 源、外源）为诱导剂。 ②反馈调节 次级代谢物的自身反馈抑制和反馈阻遏 末端产物反馈调节；生产能力与抑制浓度正相关。 分解代谢产物的调节 葡萄糖等一些碳、氮源及代谢产物有反馈抑制、阻遏作用。 初级代谢产物的调节； A 有共用合成途径，反馈抑制； B 初产物参与次合成，自反馈而影响。 磷酸盐调节； A 抑制酶的作用； B 导致细胞能荷变化； C 竞争某些金属离子的作用。 八、代谢工程 •代谢网络理论： 将细胞的生化反应以网络整体来考虑，而不是孤立地来考虑。 将代谢网络分流处的代谢产物称为节点，对终产物合成起决定作用的少数节点称主节点。 根据节点下游分支的可变程度，节点分为柔性、半柔性和刚性三类。 •改变分支途径流向，阻断其他产物合成，提 高目标产物产量。 ①加速限速反应 ②改变分支途径流向 ③构建代谢旁路 ④改变能量代谢途径 •引入外源基因后，使原来的代谢途径向后延伸，产生新的末端产物； 如： 2KLG 合成。 •引入外源基因后，使原来的代谢途径向前延伸，可利用新的原料。 如：啤酒酵母淀粉产乙醇。 ①将多基因酶克隆到不产目的产物的菌中，使之获得产目的产物的能力。 （建路） ②克隆少数基因，使原无关的两条途径联结，形成新途径，产目的产物。 （连路） ③将催化某一代谢途径的基因组克隆到 另一菌种中，使之发生代谢转移，产目的产物。 （改路） 本章知识结构 •微生物的代谢调节类型和自我调节部位 •★ 诱导酶和组成酶 •★ 酶活性调节机制 •★ 酶合成调节的机制。 • 微生物其他调节 • 代谢工程 预习内容 ——培养基 •不同碳源的利用速度 •碳氮比例的调节 第六章 培养基及其制备 提纲 •培养基的成分 能源物质 碳源物质 氮源物质 无机盐和微量元素 前体物质 促进剂和抑制 剂 水分 淀粉水解糖的制备：酸解法、酶解法、酶酸结合法 •营养物质的调节 不同碳源的利用速度 氮源利用及与碳源利用的关系 碳、氮比例的调节 前体的控制 补料 •培养基的类型 •培养基灭菌与空气除菌 一、培养基的成分 •培养基 (Culture medium)：选用各种营养物质，经配制成适合不同微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质 •培养基的组成和配比合适与否，对微生物的生长发育、产品的产量、提炼工艺的选择和成品质量都会产生相当大的影响。 一、培养基的成分 •培养基的营养成分及其功能 碳源 (Carbon source)【糖类、脂肪、有机酸】： 能源物质，构成菌体和代谢产物 氮源 (Nitrogen source)【无机氮源：氨水、硫酸铵、尿素、硝酸钠；有机氮源：发酵菌丝体、酒糟】： 构成菌体和代谢产物，硝化细菌的能源物质 无机盐类 (Mineral nutrition)【 Pb 、 Mg 、 S 、 P 、 Fe、 Co、 Zn 等】： 维持酶活力，调节渗透压、 pH 值、电位等 特殊生长因子【生物素、硫胺素、肌醇等】： 构成辅酶的组成部分，促进生命活动 水：溶解营养物质和代谢 产物 一、培养基的成分 •培养基的配置原则 根据不同微生物的需要配置不同的培养基 各种营养物质的浓度与配比，特别是 C/N 将培养基的 pH 控制在一定范围内 考虑利用价廉且易于获得的原料 •光能自养微生物：光能 如：螺旋藻生产单细胞蛋白 •化能自养微生物：氢、硫、氨、亚硝酸 盐、亚铁盐等无机物 如：细菌炼铜 •异养微生物：碳水化合物、石油、天然 气及石化产品 •碳源物质是培养基主要成分； 占细胞干物质的 50％左右，提供能源、碳架、代谢产物。 •碳源物质的易利用顺序： 葡萄糖（单）→蔗糖、麦芽糖、乳糖 （双）→糊精→淀粉 •其他碳源物质： 脂类、有机酸、石油等也能作碳源。 •糖蜜：蔗糖等的结晶母液，含糖 5070 ％，成分丰 富，物美价廉。 淀粉水解糖的制备 •糖化 (Saccharify)：在工业生产上将淀粉水解为葡萄糖的过程，得到的水解糖液叫淀粉糖。 •糖化的原料：薯类淀粉、玉米淀粉、小 麦淀粉、大米淀粉等。 •水解糖液的质量直接关系到生产菌的生长速度与代谢产物的积累，其中的低聚糖类与复合糖类等杂质越低越好。 淀粉水解糖的制备 淀粉水解糖的制备 •酸解法  反应原理：淀粉 —————— 葡萄糖  优点：设备单一、时间短（几分钟）  缺点： 对设备要求高（高温、高压、高腐蚀） 副反应多，淀粉转化率低 对原料要求高，淀粉颗粒大小均匀 淀粉乳浓度不能太高 淀粉水解糖的制备 淀粉水解糖的制备 •几种水解方法的比较  从时间上看： 酸解法最快，酶解法最慢  从 原料转化率和糖液质量上看： 酶解法 酸酶法 酶酸法 酸解法 •氮源物质是培养基的主要成分之一。 提供菌体结构物质，能源（少），含氮代谢产物。 •有机氮源：豆饼粉、花生饼粉、棉子饼粉、酵 母粉、麦麸、鱼粉、玉米浆、蛋白胨、尿素等。 成分复杂，除含蛋白质、多肽、氨基酸外，还含糖、脂、 无机盐、维生素及其他生长因子，对菌体生长非常有利。 •无机氮源：氨水、铵盐、硝酸盐 被吸收、利用快，但成分单一，常作辅助 氮源。 •无机盐：酶的激活剂，生理活性物质的组成，生理活性作用的调节剂。 主要包括： P、 Mg、 S、 Fe、 K、 Na、 Pb、 Cl、 Zn、 Co、 Mn 等。 较低浓度对细胞的生长和产物合成有促进作用，而高浓度有抑制作用。 不同菌种、不同生长阶段需求量不同。 小试常加 P、 K 、 S 、 Mg、 Fe •前体物质 (Precursor)：最终所需的代谢产物的 前身或其结构中的一部分。 •在生物合成中直接结合到产物分子中，自身结构变化不大，能显著提高产量的小分子物质。 •抗生素 (Antibiotin)发酵中常用的前体物质： 三、前体物质 •影响前体物质效力的因素  菌种的特性与菌龄 (Cell age)  前体物质的投入量 (Inoculation concentration)  前体物质的毒性 (Toxicity) 6. 促进剂和抑制剂 •促进剂 Accelerator（刺激剂 Stimulant） 并非前体或营养物，可影响正常代谢或中间代谢物积累、或 提高次级代谢物的产量的一类刺激因子。 •作用。