功能性食品学实验指导书

功能性食品学实验指导书内容摘要：

～ 80mL 以 lmL／ min 流速洗柱后，用 50％乙醇 50mL以 ／ min 12 流速洗脱，收集乙醇洗脱液，置水浴上蒸干，残渣用甲醇 溶解。 (2)阳性对照品液的制备：称取红景天苷药材粉末 ，加甲醇置 65℃ 水浴上回流 1h，过滤，滤液置水浴上浓缩至约 lmL(或称取红景天苷对照品制成 )。 (3)薄层层析：吸取样品溶液和阳性对照品液各 l0μ L，分别点 于同一块 ％ CMC硅胶G 薄层扳上，以三氯甲烷 +甲醇 (4+1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以 1％三氯化铁 +1％铁氰化钾 (1+1)新鲜混合液。 (4)结果判断：样品色谱中在与阳性对照品色谱相应位置上 (Rf值 ~)显相同的 5 个蓝色斑色。 实验四：植物黄酮类物质提取分离及检测 （一）黄酮类化合物的提取与分离 1．提取 黄酮类化合物在花、叶、果等组织中，一般多以苷的形式存在；而在木部坚硬组织中，则多以游离苷元形式存在。 黄酮苷类以及极性稍大的苷元 (如羟基黄酮、双黄酮、橙 酮、查耳酮等 )，一般可用丙酮、乙酸乙酯、乙醇、水或某些极性较大的混合溶剂进行提取。 其中用得最多的是甲醇 水 (1：1)或甲醇。 一些多糖苷类成分时。 则应当慎用，以免发生水解反应。 为了避免在提取过程中黄酮苷类发生水解，常按一般提取苷的方法先破坏酶的活性。 大多数黄酮苷元宜用极性较小的溶剂 (如氯仿、乙醚、乙酸乙酯等 )提取，而对多甲氧基黄酮的游离苷元，甚至可用苯进行提取。 对得到的粗提取物需进行精制处理，常用的方法溶剂萃取法、碱提取酸沉淀法、炭粉吸附法、树脂吸附法、离子交换法等。 1． 1 溶剂萃取法 利用黄酮类化合物与混入的杂质极性不同，选用不同溶剂进行萃取可达到精制纯化目的。 例如植物叶子的醇浸液，用石油醚处理，可除去叶绿素、胡萝卜素等脂溶性色素。 而某些提取物的水溶液浓缩后可加入多倍量高浓度醇，以沉淀除去蛋白质、多糖类等水溶性杂质。 有时溶剂萃取过程也可以用逆流分配法连续进行。 常用的溶剂系统有水 乙酸乙酯、正丁醇 石油醚等。 溶剂萃取过程在除去杂质的同时，往往还可以分离苷和苷元，或极性苷元和非极性苷元。 13 1． 2 碱提取酸沉淀法 黄酮苷类虽然有一定极性可溶于水，但却难溶于酸性水，易溶于碱性 水。 故可用碱性水提取，再将碱水提取液调成酸性，黄酮苷类即可沉淀析出。 此法简便易行，如芦丁、橙皮苷、黄芩苷的提取都应用了这个方法。 以从槐米中提取芦丁为例说明该法的操作过程。 槐米（槐树 Sophora japonica L. 的花蕾）中加约 6 倍量水，煮沸，在搅拌下缓缓加入石灰乳至 pH 值8~9，在此 pH 值条件下微沸 20~30min，趁热抽滤，残渣中再加入 4 倍量的水煎一次，趁热抽滤。 合并滤液，在 60~70℃的条件下，用浓盐酸将合并滤液调至 pH 值为 5，搅匀后静置24 h，抽滤。 用水将沉淀洗至中性， 60℃干燥得芦丁粗品， 用沸水重结晶， 70～ 80℃干燥后得芦丁纯品。 在用碱提取酸沉淀法进行提取纯化时，所用碱液浓度不宜过高，以免在强碱性下，尤其加热时破坏黄酮母核。 在加酸酸化时，酸性也不宜过强，以免生成盐，致使析出的黄酮类化合物又重新溶解，降低产品收率。 当药材中含有大量果胶、黏液等水溶性杂质时，如花、果实类药材，宜用石灰乳或石灰水代替其他碱性水溶液进行提取，以使上述含羧基的杂质生成钙盐沉淀，不被溶出，这将有利于黄酮类化合物的纯化处理。 1． 3 炭粉吸附法 主要适于苷类的精制。 通常，在植物的甲醇粗提取物中，分次加 入活性炭，搅拌，静置，直至定性检查上清液中无黄酮时为止。 过滤、收集炭末，依次用沸水、沸甲醇、 7％酚 (水溶液 )、 15％酚 (醇溶液 )进行洗脱。 对各部分洗脱液进行定性检查 (或用 PPC 鉴定 )。 通过对Baptisia lecontei 中黄酮类化合物的研究证明，大部分黄酮苷类可用 7％酚 (水溶液 )洗下。 洗脱液经减压蒸发浓缩，再用乙醚振摇除去残留的酚，余下水层减压浓缩即得较纯的黄酮苷类成分。 1． 4 树脂吸附法 (1)吸附树脂的种类 吸附树脂有许多品种，吸附能力和所吸附物质的种类也有区别。 但其共同之处是具 有多孔性，并具有较大的比表面积。 吸附树脂按其化学结构，可以分为以下几类。 ①非极性吸附树脂。 一般是指电荷分布均匀，在分子水平上不存在正负电荷相对集中的极性基团的树脂。 如由二乙烯苯 (DVB)聚合而成的吸附树脂 Amberlite XAD4(美国 )、 XADdaionHP ADS5(中国 )等。 ②极性吸附树脂。 ，如 COOR，具有一定的极性，如 Amberlite XAD6(美国 )、 ADS8(中国 )等。 、亚砜、腈等基团，这些基团的极性 大于酯基。 ，如吡啶基、氨基等。 14 (2)吸附树脂的结构 吸附树脂的特点主要是多孔性。 孔的结构、孔径、孔体积及孔的表面积等是影响其性能的关键因素。 与其他吸附剂不同的是，吸附树脂的孔结构及各项指标可在很大的范围内进行调整，其化学结构也有很大的变化余地。 因而吸附树脂有很多性能不同的品种规格，可以满足多种应用领域的要求。 吸附树脂的表面积很大，这是其具有良好吸附能力的基础。 树脂颗粒的外表面积很小，一般在 ／ g 左右。 而其内部孔的表面积却很大，多为 500～ 1000m2／ g。 这就是说，若将 lkg 吸附树脂的孔展开。 其面积有 ～ lkm2 之大。 (3)吸附树脂的性能 吸附树脂的性能包括许多方面，如对溶液中的溶质的吸附量、吸附率、吸附速度、选择性、脱附性能等。 在实际应用工艺中，对树脂性能的要求往往是全面的，任何一项性能的缺陷都可能成为应用工艺成败的关键。 上述性能的基础是吸附树脂在吸附时所显示的吸附平衡和吸附动力学特性。 (4)吸附树脂的使用方法 吸附树脂的体积一般来说小于其合成时所用致孔剂的体积。 因此在生产过程或去除致孔剂的过程中就出现了缩孔的现象。 吸附树脂不宜干燥 ，原因是易引起缩孔，使树脂吸附性能下降。 商品吸附树脂都是含水的，在储存过程中有可能会因失水而缩孔。 另一方面，商品吸附树脂在出厂前也未进行彻底清洗，不可避免地会残留一些原料或副产物，因而在使用前必须进行预处理，以去除树脂所含的杂质，合理的处理方法还可以使树脂的孔得到最大限度的恢复。 吸附树脂的预处理应在树脂柱中进行。 一般是将树脂装至柱高的 2／ 3 处。 用水进行冲洗，使树脂层松散、展开，将树脂的细粉末及一些机械杂质洗去。 然后放出水，至水面略高于树脂的层面。 接着，用乙醇以适当的流速淋洗，至流出的乙醇中无脂溶性 杂质为止。 最后，用水洗出乙醇即可使用。 如果为了更彻底的清洗，则可用 ／ L 的酸和碱溶液分别冲洗，使树脂既得到清洗，又得到再生。 吸附树脂的吸附方式主要为静态吸附和动态吸附。 静态吸附可在带搅拌的釜或槽中进行。 溶液黏度大，悬浮物较多或分配比较大时可用此方式。 动态吸附实际上树脂是固定，只是溶液是流动的，它使用的装置与常规的离子交换柱相同，有玻璃柱、不锈钢柱和搪瓷柱。 1． 5 离子交换法 离子交换法可用于除去黄酮类化合物中的水溶性杂质。 因为阳、阴离子交换树脂均可吸附黄酮类化合物成分。 当含黄 酮的水溶液通过树脂时，黄酮类化合物被吸附在树脂上，而其他水溶性杂质可用水洗脱。 然后用甲醇将黄酮化合物从树脂上洗脱下来。 从稀水溶液中提取黄酮类化合物采用树脂法是很适宜的。 此外，树脂还可以用来精制黄酮类化合物与金属离子 15 形成的盐类或配位化合物，如芦丁与三氯化铝形成配位化合物后上阳离子交换树脂柱，用水洗除去杂质后，再用乙醇洗脱可得到较纯的黄酮类化合物。 另外用铅盐法精制、分离黄酮时，也可以用阳离子交换树脂柱进行脱铅处理。 1． 6 其他方法 目前已有用超临界二氧化碳 (SCCO2)萃取法提取银杏黄酮等成分的报 道。 该方法被视为环境友好且高效节能的提取分离新技术，已受到重视。 现在普遍认为该方法特别适合于提取天然热敏性、弱极性且附加值高的天然物质。 此外，还有用超滤法提取黄芩苷、用超声波法提取黄酮类化合物的报道。 分离 对黄酮类化合物进行分离，其主要依据有以下几点。 ①极性大小不同。 利用吸附或分配原理进行分离。 ②酸性强弱不同。 利用梯度 pH 值萃取法进行分离。 ③分子大小不同。 利用葡萄糖凝胶分子筛或膜技术进行分离。 ④ 分子中某些特殊结构。 利用金属盐配位化合能力不同等特点进行分离。 常用的分离方法有柱色谱法、萃取法、铅盐法， HPLC 法、超临界流体色谱分离。 2． 1 柱色谱法 分离黄酮类化合物常用的吸附剂或载体有硅胶、聚酰胺及纤维素粉等。 此外，也有用氧化铝，氧化镁及硅藻土等。 (1)硅胶柱色谱 此法应用范围最广，主要适于分离异黄酮、二氢黄酮、二氢黄酮醇及高度甲基化 (或乙醚化 )的黄酮及黄酮醇类。 少数情况下，在加水去活化后也可用于分离极性较大的化合物，如多羟基黄酮醇及其苷类等。 供试硅胶中混存的微 量金属离子，应预先用浓盐酸处理除去，以免干扰分离效果。 (2)聚酰胺柱色谱 对分离黄酮类化合物来说，聚酰胺是较为理想的吸附剂。 其吸附强度主要取决于黄酮类化合物分子中羟基的数目与位置及溶剂与黄酮类化合物或与聚酰胺之间形成氢键缔合能力的大小。 聚酰胺柱色谱可用于分离各种类型的黄酮类化合物，包括苷及苷元、查耳酮与二氢黄酮等。 以 Bapti。