生物技术专业生物化学课程教学教案

生物技术专业生物化学课程教学教案内容摘要：

反平行结构（相邻肽链反向），见 P210图 518。 （ 3） β 转角和 β 凸起 β 转角是球状蛋白的一种简单的二级结构组件。 为第一个氨基酸残基的羰基与第四个残基的 NH 氢键键合，形成一紧密的环在肽链回折或弯曲时形成，使多肽链出现 1800 急剧回折，见 P211 图 519。 β 转角处 Gly 和 Pro 出现几率很高。 β 凸起：是在 β 折迭股中额外插入一个残基，凸起股产生小弯曲（ P212 图520），可引起肽链方向稍有改变。 （ 4） 无规卷曲：泛指那些不能归入明确的二级结构的多肽区段，实际上不是完全无规，而是像其它二级结构那样具有明确而稳定的 结构。 常构成酶的活性部位和蛋白质的功能部位。 （五）超二级结构 若干相邻的二级结构单元彼此相互作用，形成种类不多、有规则的二级结构组合或二级结构串，在多种蛋白质中充当三级结构的构件，如 P221 图 529 所示，有 αα，βαβ等。 （六）结构域 多肽链在二级结构或超二级结构基础上形成的三级结构（局部折迭区），是相对独立的紧密球状实体，称为结构域或域，是球状蛋白质的独立折迭单位。 对于较小的球状蛋白质分子或亚基，结构域就是三级结构；对于较大的球状蛋白之或亚基，其三级结构往往由两个 或多个结构域缔合而成，为多结构域。 结构域形成再缔合成三级结构动力学更为合理，特定三维排布的结构域形成，有利于结构域之间活性中心的形成，结构域之间的柔性肽链形成的铰链区有利于活性中心与底物结合，以及别构中心结合调节物发生别构效应。 （七）球状蛋白质的三级结构 球状蛋白质三级结构具有明显的折迭层次： 二级结构 → 超二级结构 → 结构域 → 三级结构 → 四级结构（多聚体）。 分子是紧密球体或椭球状实体，所有原子体积占 72~77%，空腔约 25%。 疏水侧链埋藏在分子内部，亲水侧链暴露在分子表面，球状蛋白是水溶性的。 球状蛋白表面上的疏水空穴常用于结合底物、效应物等配体，为行使生物功能的活性部位。 （八）蛋白质折迭和结构预测 （ 1） 蛋白质变性：天然蛋白质分子受某些物理化学因素，如热、紫外线照射或酸、碱、有机溶剂、变性基的影响生物活性丧失，溶解度降低及物理化学常数改变的过程称为蛋白质变性。 蛋白质变性为分子中次级键破坏，天然构象解体，但变性不涉及共价键（肽键和二硫键）的破裂，一级结构保持完好，只是物化性质和生化性质改变。 变性剂： ① 能与多肽主链竞争氢键，破坏二 级结构，如尿素、盐酸胍等； ② 表面活性剂：破坏蛋白质疏水相互作用，使非极性基团暴露于介质水中，如十二烷基硫酸钠。 变性是一个协调过程，在所加变性剂很窄的浓度范围内，或很窄的 pH 或温度区间内突然发生。 （ 2） 氨基酸序列规定蛋白质的三维结构 核糖核酸酶的变性和复性试验： 牛胰核糖核酸酶，为 124 个氨基酸残基组成单链，包含四个二硫键。 变性：加 8mol/L 尿素或 6mol/L 盐酸胍和巯基乙醇（还原二硫键），酶变性，紧密结构伸展成松散的无规卷曲构象。 复性：将尿素等变性剂和巯基乙醇用透析法除去，酶活性又可恢复，最后达原活性 的 95~100%。 P235 图 549。 加入极微量巯基乙醇，有助于二硫键重排，加速酶的复性。 复性：变性的蛋白质在一定条件下重建其天然构象恢复其生物活性。 蛋白质天然构聚处于能量最低状态，理论上变性是可逆的，但实际上由于复性所需条件复杂，不易满足而常常遇到困难。 根据分子生物学一个中心原理：顺序规定构象，活性依靠结构，蛋白质结构是可预测的。 全新蛋白质设计和蛋白质工程更需要蛋白质结构预测。 （九）亚基缔合和四级结构 （ 1） 蛋白质四级结构涉及亚基种类和数目，以及亚基在整个分子中空间排布（对称性），亚基的接触位点（ 结构互补）和作用力（主要是非共价相互作用）。 大多数寡聚蛋白质分子亚基数目为偶数，亚基种类一般是 1 或 2 种。 （ 2） 四级结构缔合的驱动力：弱相互作用（氢键、疏水相互作用，范氏力，盐键），有的亚基聚合还借助亚基之间的二硫桥，如抗体是由两条重键和两条轻链组成的四聚体，二硫键将两条重链与轻链连接在一起， P276 图 629。 （ 3） 亚基缔合方式：亚基缔合主要是疏水相互作用，缔合专一性则由表面的极性基团的氢键和离子键提供。 许多蛋白质借异种缔合（相同亚基，但相互作用表面不同）。 形成线性或螺旋形的大聚合体，如病毒颗粒外壳， P248 图 556 显示人免疫缺陷病毒（ HIVI）的核壳由几百个外壳蛋白亚基组成。 （ 4） 四级结构对称性：是四级结构蛋白主要性质之一，有旋转对称轴，如二聚体，四聚体。 （ 5） 四级缔合在结构和功能上具有优越性：可增强结构稳定性，提高遗传经济性和效率，使编码所需 DNA 减少，可使催化基团汇集在一起；具有协同性和别构效应。 别构效应：多亚基蛋白质一般具有多个结合部位，结合在蛋白质分子的特定部位上的配体对该分子和其它部位所产生的影响（如改变亲和力或催化能力）称为别构效应。 具有别构效应的蛋白质为别构蛋白质，酶称为别构酶，具有调节代谢 的功能。 第六章、蛋白质结构与功能的关系（ P252） 本章的重点：这也是蛋白质化学中最为重要的一章，要求学生重点掌握，特别是蛋白质结构和功能的关系及其研究在生命科学中的重要地位。 本章主要讲述的内容为： 从厌氧生物转化为好氧生物是生物进化中的一大进步。 脊椎动物中血红蛋白在血液中起到载氧和输氧的作用，肌红蛋白在肌肉中起贮氧和氧在肌肉中分配的作用。 （一） 肌红蛋白（ Mb）的结构与功能 （ 1） 三维结构：由一条多肽链和一个血红素辅基构成，相对分子量 16700，含 153个氨基酸残基。 分子中多肽链由 8 段 α 螺旋组成，分子结构致密结 实，带亲水基团侧链的氨基酸分布在分子外表面，疏水氨基酸侧链几乎全埋在分子内部，见 P253 图61。 （ 2） 辅基血红素：由二价铁和原卟啉 Ⅸ 组成，原卟啉 Ⅸ 由 4 个吡咯环组成，见 P254 图 62。 铁原子只有亚铁态的蛋白质才能结合氧。 蛋白质提供疏水洞穴，固定血红素基，保护血红素铁免遭氧化，为氧提供一个结合部位。 结合氧只发生暂时电子重排。 （二） 血红蛋白 (Hb)的结构与功能 （ 1） 血红蛋白由 4 个多肽链（亚基）组成，如α 2β 2（成人血红蛋白 HbA），每个亚基都有一个血红素基和一个氧结合部位，α 链有 141 个残基，β 链有 146 个残基 ，且α链、β链和 Mb 的三级结构都非常相似（ P259 图 69）。 实际上对于人的这三种多肽链分析发现只有 27 个的残基是共有的，这表明蛋白质高级结构的保守性。 只要功能相同（都与氧结合），高级结构就相似，有时甚至是唯一的。 血红蛋白与肌红蛋白结构上最大不同在于血红蛋白有四级结构，是四聚体，而肌红蛋白只有三级结构。 因此血红蛋白运载氧能力增强，还能运载 H+和 CO2，在氧分压变化不大范围内完成载氧和卸氧工作。 且 Hb 为变构蛋白，可受环境中其它分子，如 H+， CO2 和 2， 3二磷酸甘油酸（ BPG）的调节。 （ 2） 氧结合引起血红蛋 白构象变化，氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白在四级结构上有显著不同，发生构象变化。 氧与血红蛋白结合是协同进行的，具有正协同性同促效应，即一个氧分子与 Hb结合，使同一 Hb 分子中其余空的氧结合部位对氧亲和力增加，再结合第二、三、四个氧分子则比较容易。 （ 3） Hb 和 Mb 氧合曲线如 P262 图 614 所示。 P(O 2)：氧分压，表示氧的浓度（氧浓度与氧分压成正比）。 Y：氧饱和百分数，为被占氧合部位与氧合部位总数之比。 当 Y=0，所有氧合部位空着； Y=1，所有氧合部位被氧占据； Y=，半载，此时所需氧分压大小为对氧亲和 力指标。 Mb 氧合曲线为双曲线； Hb 氧合曲线为 S 型曲线。 S 曲线分析： ① 肺区氧分压较高， P（ O2）约为 100torr（空气中氧分压 760 21%=160torr）， Y=，近于 1，载氧。 ② 组织肌肉中需氧， P（ O2）约为 20torr， Y=，卸氧。 ③ Δ Y：氧饱和百分数变化；Δ P（ O2）：氧分压变化。 肺区和组织肌肉中氧分压变化：Δ P（ O2） =100―20=80torr ， Hb 氧饱和百分数变化为，Δ Y=―= ，表示有近 3/4 氧可从 Hb 上卸下。 由此可知在 S 曲线上，即使 P（ O2 ）变化不大（仅 80torr） ,也有较多的氧卸下，输氧效率较高，可完成输氧，Δ P（ O2）在 20~100torr 范围变化，为 Hb 工作区；相比 Mb 的双曲线，Δ P（ O2）在 20~100torr 范围变化，Δ Y 只有 ，表示氧不易卸下，只能担负贮氧功能。 Hb 与 Mb 功能差别只是因为 Hb 有四个亚基，有四级结构，可进行协同载氧和卸氧工作， Mb 只能贮氧。 （ 4） H+， CO2 和 BPG（ 2， 3二磷酸甘油酸）对血红蛋白结合氧的影响 ： 它们与 Hb 结合部位离血红素基甚远，是通过别构效应调节 Hb 与氧的结合。 1. 波尔效应（ Bohr）： pH 降低（ H+增加）， CO2 压力增加均降低血红蛋白对氧亲和力，促进血红蛋白释放氧；反之高浓度氧又促使脱氧血红蛋白释放 H+和 CO2。 P264 图 617： pH 减少使 S 曲线右移，而 H+增加、 CO2 增加均使 pH 减少。 生理意义：在组织区 CO2 产生，为高 CO2 区， pH 约 ，有利于 Hb 释放氧，载 CO2；在肺区氧吸入， pH 约 ，有利于 Hb 与氧结合，放出 CO2。 2. BPG 降低 Hb 对氧亲和力： BPG 可由糖代谢产生，正常人血液中约含 ，约与血红蛋白等摩尔数。 P265 图 619 显示出在不 同 BPG 浓度下血红蛋白的氧合曲线， BPG 浓度增加，Hb 氧合曲线右移。 ① 无 BPG， Hb 氧合曲线为双曲线，不易卸氧； ② 当 BPG=（正常生理状况），为 S 型曲线，可卸氧，此时 P（ O2）=26torr， Y=； ③ 当 BPG=（非正常生理状况如高山反应，及病理状况如肺气肿），S 曲线右移，更易卸氧，满足肌体对氧需求，此时 P（ O2）为 34torr， Y=。 （三） 血红蛋白分子病 人类已发现 300 多种不同突变的血红蛋白，许多突变是有害的，产生遗传病，如镰刀状细胞贫血症： 病状：贫血症； 检查：血液中含大量镰刀形红细胞 HbS，没有足够可承担输氧的正常圆形细胞HbA。 镰刀状细胞贫血病是血红蛋白分子突变引起的。 研究：电泳发现 HbS 和 HbA 电泳速度和等电点均有差异。 在 下均向正极移动，但 HbS 比 HbA 稍慢，说明 HbS 比 HbA 少几个带负电荷基团。 氨基酸测序发现 HbA 与 HbS 区别在于 β 链上 6位 Glu（ HbA）变为 Val（ HbS），结果由于疏水相互作用， β 链上 6Val 与 1Val 接近，使血红蛋白分子从扁平状压缩变形，形成细长聚集体红细胞，构成镰刀形，与氧结合力降低。 值得注意的是血红蛋白分子四条肽链共 574 个氨基酸残基，只两个 β 链上的氨基酸被代替（ 2Glu→ 2Val），即引起如此严重疾病。 第 7 章、蛋白质的分离纯化和表征（ P290） 本章重点介绍蛋白质的分离纯化方法、所注意的事项、分离纯化蛋白质的意义、新技术、新方法和新突破等。 主要讲课内容为： （一） 蛋白质分子量测定： （ 1） 根据化学组成测最低分子量： 1. 肌红蛋白、血红蛋白均含铁 %，分别求它们的最低分子量： 肌红蛋白为 （ Fe 原子量） 247。 100=16700，与其它方法测分子量相符。 血红蛋白含铁 也是 %，最低分子量也为 16700，但用其它方法测分子量为68000，即每一个血红蛋白含有 4 个铁原子，由此计算更为准确分子量为： 167004=66800。 2. 由氨基酸含量计算： 如牛血清清蛋白含 %，蛋白质最低分子量为 35200；每一牛血清蛋白含有2 个 Trp，所以分子量为 70400，比其它方法测出的准（ 69000）。 （ 2） 沉降系数和沉降系数单位： 蛋白质分子在溶液中受强大离心力作用时，蛋白质分子沉降，沉降速度与蛋白质分子大小和密度、分子形状等有关，可用于测分子量。 沉降系数：蛋白质颗粒在单位 离心场的沉降速度是个定值，称为沉降系数或沉降常数用 s 表示。 s 常用来近似描述生物大分子的大小，蛋白质、核酸、核糖体和病毒的沉降系数介于 1 1013到 200 1013sec范围，见 293 表 74。 为方便起见，把 1013sec 作为一个单位 ,称为 svedberg（斯维得贝格）单位或沉降系数单位，用 S 表示，如人的 Hb 沉降系数为 ，即为 1013sec。 （二） 蛋白质胶体性质与蛋白质的沉淀： 蛋白质溶液属胶体系统，分散相质点大小 1~100nm。 蛋白质可用盐析，有机溶剂沉淀，生成重金属盐、加生物 碱和某些酸类（如三氯乙。