生物工程下游技术实验讲义

生物工程下游技术实验讲义内容摘要：

中各种带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异进行物质分离的操作技术 ,由于具有简便、高效、成本低 ,且可自动化连续操作的优点 ,因此一直以来都是溶菌酶生产所常用的方法。 常用的离子交换剂有 Duolite 46羧酸纤维素 (PC)、羧甲基纤维素 (CMC)和羧甲基琼脂糖等。 Li Chang等用Duolite464从性质均一的蛋清溶液中分离溶菌酶 ,建立的一种简便而有效的工艺过程 ,可使溶菌酶的回收率 高达 9095 %。 同时采用 Duolite464分离纯化溶菌酶适合于连续自动化操作。 Durance 等也采用 Duolite464从未被稀释的蛋清溶液中同时分离溶菌酶和抗生素蛋白 ，但 得率与酶活都不太理想。 陕西科技大学的9 朱宏新等人采用弱酸性阳离子交换树脂 (724 树脂 )动态交换洗脱纯化工艺对鸡蛋壳中的溶菌酶进行分离 ， 724 树脂的吸附率达到 %。 一般的离子交换剂都具有刚性小、收缩性大、再生手续麻烦 ,且易被柱堵塞的弊端 ,而李蓉等采用硅胶基质弱阳离子交换剂 XIDACE－ WCX作为填料制作的色谱分离纯化蛋 清中的溶菌酶克服了上述的弊端 ,获得了良好的分离效果 ,活性回收率为 107% ,蛋白的比活为 15467 U/mg,纯化倍数提高了 倍。 这种方法比传统的软基质离子交换色谱分离法速度快 ,纯化效率高。 Ghosh R采 polyvinylidine fluoride(PVDF)膜从蛋清中纯化溶菌酶 ,此膜通过离子交换机制选择性地结合溶菌酶 ,它对大量各种各样的有机溶剂、酸等有抑制作用 ,能通过加热复性而不改变膜的孔度 ,与其他合成膜比不易阻塞、更耐用。 3）超滤 超滤技术与传统的生化分离技术相比主要的优点是产品的高产出量 ,然而尽管超滤技术在反渗析及浓缩等过程中得到广泛的应用 ,但是它作为在生物工业领域中潜能很大的一种蛋白质分离技术仍然未被得到充分利用。 运用超滤技术可以很好地通过调节而获得高产量和高纯度的产品 ,如果在无菌条件下操作 ,可以直接生产无菌的溶菌酶溶液 , 直接用于临床治疗。 Ghosh R 等 1999 年报道使用经肌血球素预先处理的 50 kDa MWCO聚砜膜的超滤系统分离溶菌酶。 利用这种经预先处理过的膜可使溶菌酶的通过量比未经处理的膜提高大约 26% ,而其他的蛋清蛋白质的通过量依赖于透膜压 ( transmembrane pressure,TMP)。 随着透膜压的升高 ,通过量下降 ,因此通过表面预处理和透膜压调节两种方法综合使用 ,可使溶菌酶全部通过而其他蛋清蛋白质几乎全部截留。 在透膜压为 20 kPa 时 ,溶菌酶的纯度为 18 %,而在 120 kPa时 ,纯度超过 96%。 （二）分离纯化方法新进展 1）色谱分离技术 色谱分离技术有多种类型 ,其中膜色谱技术是将液相色谱与膜分离结合起来的一种新技术 ,具有快速、高效、高选择性、易于放大的特点 ,能满足生物大分子 高效分离与纯化的要求 ,它作为一种高效的分离纯化技术已受到人们的高度重视 ,广泛地应用 于大分子物质的纯化。 在膜色谱中，又和亲和、离子交换等技术结合，衍生出亲和膜色谱技术、离子交换膜色谱技术，均有研究者将其应用到溶菌酶的10 分离纯化中。 高速逆流色谱 (HSCCC)技术是一种无固体载体的连续液 液分配色谱技术 ,其固定相通过重力场和离心力作用被包。 保留在分离柱内 ,避免了固体载体与样品发生化学反映而不可逆吸附 ,样品回收率高 ,郅文波等人利用多分离柱高速逆流色谱 ,研究聚乙二醇 1000(PEG1000)磷酸盐双水相体系的固定相保留率及该体系对蛋白质混合物进行分离 ,以 14%PEG100016%的磷酸盐体系的 上相为固定相 ,在流速 0. 6mol/min和转速 900r/min 的条件下 ,根据细胞色素 C、溶菌酶、和血红蛋白三者的分配系数的不同对其进行分离 ,三者的收率均大于 90%。 20世纪 80年代末出现了亲和色谱技术 ,以亲和力为基础的生物分离技术是将可逆结合的配基 (ligand) 与不溶性的载体 (matrix) 偶联 ,形成具有特异亲和性的分离介质 ,并用其来选择性的吸附生物活性物质 ,再通过洗脱来分离所需要的物质。 西安交通大学李剑君运用间歇式吸附与连续式脱附耦合亲和层析法分离纯化了溶菌酶 ,比较了间歇式吸附和连续式吸附在操 作时间上的差异 ,蛋白质回收率和吸附剂利用率都有所提高。 Anca, M. Yakup将染料配基 (Blue 4 和 Red120) 偶联到凝胶上 ,制备出新型的亲和层析介质 ,分离纯化溶菌酶。 通过对这种新型亲和染料 配基复合膜对溶菌酶的吸附及动力学特征进行研究 ,结果表明这种染料 配基复合膜与普通膜对溶菌酶的吸附能力分别是 ,提高了。 此外，还有固定金属亲和层析方法、亲和沉淀法、亲和过滤法等以亲和力为基础的分离技术，可应用到溶菌酶的分离纯化中。 2）反胶团萃取 反胶团萃取是近年发展起来的一种新的萃取方法 ,它是利用有机溶剂中加入少量表面活性剂形成的反胶团来提取的方法 ,为一些不能使用有机溶剂萃取的酶和活性蛋白质等生物活性物质开拓了一种新的分离技术 ,扩大了有机溶剂萃取的适用范围。 Sun Y等采用一种亲和染料基质反胶团系统从鸡蛋清粗溶液中纯化溶菌酶 ,这种反胶团是由辛巴蓝 F3G－ A与改良的大豆卵磷脂在正己烷中反应制得。 用粗蛋清溶液进行分离纯化 ,可使溶菌酶的纯度提高 16～ 20 倍 ,达到 ～ mg/ mg 蛋白 ,这种亲和反胶团系统可以重复使用三次 , 加入聚氧乙 烯 (120) 去水三梨糖醇三油酸酯 ( Tween85)作为辅助表面活性剂可以提高反胶团系统的容量。 在 pH 11 ,使用含有 Tween85(20g/L) 的反胶团可以使溶菌酶的产率超过70%。 3） 膨胀床吸附 法 膨胀床吸附技术能直接从未经固液分离的生物产品料液中捕集目标产品 ,集固液分离、吸附纯化为一体 ,是一个过程集成的操作 ,可以直接从含有细胞或细胞碎片等固体颗粒的高粘度料液中分离纯化目标产物。 膨胀床吸附 不仅克服了固定床吸附的缺点 ,而且缩短处理时间 ,简化步骤 ,提高了产品的产量和质量。 Tong XD 等报道使用被辛巴蓝 3GA修饰的一种定制的 Nd－ Fe－ B密实合金琼脂糖凝胶 ,扩张床吸附系统吸附、纯化溶菌酶的结果与使用 CB 修饰的直线型凝胶 (CB－StreamLine) 相比较 ,具有更高的纯化倍数。 Owen 等报道使用连续逆流、扩张床吸附系统分离溶菌酶 ,该技术克服了一般填充床柱层析的一些存在问题 ,诸如填充材料的压实、沟槽的形成和由于上样溶液微粒引起的柱阻塞等。 溶菌酶研究和应用展望 在环境污染日趋严重的当今世界，在倡导绿色食品的今天，溶菌酶作为一种天然蛋白质，能在胃肠内作为营养物质被消化和吸收，对人 体无毒性，也不会在体内残留，是一种安全性很高的食品保鲜剂、营养保键品和药品。 另外，由于人溶菌酶在参与机体的防御机制，在抗感染、抗肿瘤和免疫调节等方面的作用具有其他来源的溶菌酶无法比拟的优势，具有可观潜在的临床应用价值，因此有关人溶菌酶的应用研究以及如何实现工业化生产已引起广泛的重视。 采用当前的基因工程技术，利用原核或真核生物作为寄主细胞，从而为实现大规模生产人溶菌酶提供了可行的途径。 这必将把溶菌酶的研究利用推入一个崭新的阶段。 参考文献 [1] 刘源岗 ,邓倩莹 ,廖问陶 等 . 溶菌酶的活性测定 .食品科 技 ,2020,10:7173. [2] 于滨 ,迟玉杰 . 高活力蛋清溶菌酶制备技术的研究 .农产品加工 学刊 ,2020,4:46. [3] 洪潇 ,余若黔 . 溶菌酶的活性测定方法 . 生物技术通报 ,2020,5:4042. 12 第 二部分 实验部分 实验一 层析柱装填及柱效测定 一、 实验目的和内容 目的： 1. 掌握凝胶过滤层析的原理，掌握凝胶柱柱效测定方法； 2. 熟悉凝胶层析的一般过程； 3. 了解凝胶介质的选择原则和应用领域。 内容： 1. Sephadex G50 凝胶柱的装填； 2. 凝胶柱柱效测定。 3． 凝胶再生的方法； 二、 实验仪器和试剂 1. 实验仪器 层析柱（ 1 40 cm），砝码天平，玻璃棒， 分部收集器，核酸蛋白质检测仪，记录仪，滴头吸管， 2. 实验材料和试剂 Sephadex G50， ， 5％丙酮（ PBS 缓冲液作为溶剂） 三、 实验步骤 清洗层析柱 测定层析柱的内径、高度，计算所需凝胶的体积 根据 Sephadex G50的膨胀体积，计算所需干凝胶的质量 称取相应质量 的干凝胶，加入其总吸液量 10倍的 mol/L PBS 在 100℃水浴中加热溶胀 1 小时以上，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去 13 用真空干燥器抽尽凝胶中空气，并将凝胶上面过多的溶液倾出 关闭层析柱出水口，向柱管内加入约 1/4 柱容积的洗脱液 （重复使用的填料，从此步开始） 边搅拌，边将薄浆状的凝胶液连续倾入柱中，使其自然沉降 等凝胶沉降约 23cm 后，打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉积 待沉积的胶面上升到离柱的顶端约 5cm 处时停止装柱，关闭出水口 通过 23 倍柱床体积的洗脱液 使柱床稳定 (流速 ～ 1 mL/min) 始终保护凝胶上端有一段液体 准备好恒流泵、分部收集器、核酸蛋白检测仪及记录仪 打开柱上端的螺丝帽塞子，吸出层析柱中多余液体直至与胶面相切 沿管壁将 5%丙酮溶液 mL 小心加到凝胶床面上，应避免 将床面凝胶冲起 （参考完成时间 11： 30） 打开下口夹子，使样品溶液流入柱内，同时收集流出液，当样品溶液流至与胶面相切时，夹紧下口夹子 按加样操作，用 1 mL 洗脱液冲洗管壁 2次 加入 3－ 4 mL 洗脱液于凝胶上，旋紧上口螺丝帽 14 将层析柱进 水口连通恒流泵，柱出水口与核酸蛋白质检测仪比色池进液口相连，比色池出液口再与自动部分收集器相连，用两根导线将检测仪与记录仪连接起来，设置好基线的位置 洗脱时，打开上、下进出口夹子，用 ，以 ～ 1 mL/min 流速洗脱，记录 tr(记录仪纸速设为 12cm/h，电压 200mv；核酸蛋白监测仪检测波长 254nm，灵敏度为 )， 计算 单位高度的 柱效 （参考完成时间 16：00） 柱效计算公式： N = ?［ θ r/( W 1/2)］ 2 其中， θ r为平均洗脱 时间， W 1/2为半峰宽。 均为无因次特性值， 测量时精确到 1mm。 [Sephadex G100每米理论塔板数为 3000～ 6000] 四、 注意事项 1）各接头不能漏气，连接用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。 2）装柱要均匀，既不过松，也不过紧，最好在要求的操作压下装柱，流速不宜过快，避免因此压紧凝胶。 3）始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分蒸发，凝胶变干。 也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动。 4）所用凝胶比较昂贵，需小心 操作，实验后回收，尽量避免浪费和损失。 五、 演示 核酸蛋白检测仪及记录仪操作方法 在仪器使用前，首先检查检测器，电源和记录仪三部份电路连接是否正确，插上电源插头。 接通记录仪电源开关，使电源开关拔到“通”指示灯亮。 可根据需要调换不同的走纸速度。 记录仪量程调在 10mV 档上。 将检测仪波长旋钮旋到所需波长刻度上，把量程旋钮拔到 100％ T 档。 15 按下检测仪电源箱面板上的电源开关，此时记录仪指针从零点开始向右移动某一刻度，调节“光量”旋钮使指针停留在记录仪大约中间位置 5mV 左右数字显示为 50左右。 仪器开 机稳定时间大约在 1 小时左右，待基线平直后，可加样测试。 把检测器进样口塑料 胶 管接到部份收集器上，使层析柱中的洗脱液通过。 透光率为“ 0”厂家巳调好，光密度 A 要调零，量程开关拔到 100％ T，调节光量旋钮，使记录仪指针在 10mV 数字显示为 100，即透光率为 100%。 把量程开关拔到“ A”挡，缓慢调节 A 调零旋钮，使检测仪数字显示为“ 0” ， 同时调节记录仪零位旋纽使记录仪指示在 0位。 上述 5 个步骤结束后，就可以在层析柱上加样。 当样品经层析柱分离，通过检测后，就能通过记录仪给出所需样品吸收的图谱。 测 试完毕，必须切断电源，并用蒸馏水清洗样品池和尼龙管。 记录仪光吸收 A读数 当采用 l0mV 量程记录仪时，记录仪的满量程读数对应于 A 量程开关所对应的 A 读数范围。 如 A量程开关选定在 时，则记录仪满量程光吸收 A 读数为 ，当记录笔指示在记录纸一半 (50%刻度 )位置时即为。 数字显示光吸收 A 读数。