分子生物学与基因工程实验教学大纲

分子生物学与基因工程实验教学大纲内容摘要：

CaCl2 法 ) 将培养液转入离心管中 ,冰上放置 10分钟 ,然后于 4℃下 3000g离心 10分钟。 弃去上清 ,用预冷的 ,冰上放置 1530分钟后 ,4℃下 3000g离心 10分 钟。 弃去上清 ,加入 4ml预冷含 15%甘油的 ,轻轻悬浮细胞 ,冰上放置几分钟 ,即成感受态细胞悬液。 感受态细胞分装成 200μ l的小份 ,贮存于 70℃可保存半年。 三、 转化 从 70℃冰箱中取 200μ l感受态细胞悬液 ,室温下使其解冻 ,解冻后立即置冰上。 加入 pBS质粒 DNA溶液 (含量不超过 50ng,体积不超过 10μ l),轻轻摇匀 ,冰上放置30分钟后。 42℃水浴中热击 90秒或 37℃水浴 5分钟 ,热击后迅速置于冰上冷却 35分钟。 向管 中加入 1ml LB液体培养基 (不含 Amp),混匀后 37℃振荡培养 1小时 ,使细菌恢复正常生长状态 ,并表达质粒编码的抗生素抗性基因 (Ampr )。 将上述菌液摇匀后取 100μ l 涂布于含 Amp的筛选平板上 ,正面向上放置半小时 ,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿 ,37℃培养 1624小时。 同时做两个对照 : 对照组 1: 以同体积的无菌双蒸水代替 DNA溶液 ,其它操作与上面相同。 此组正常情况下在含抗生素的 LB平板上应没有菌落出现。 对照组 2: 以同体积的无菌双蒸水代替 DNA溶液 ,但涂板时只取 5μ l 菌液涂 布于不含抗生素的 LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。 四、 计算转化率 统计每个培养皿中的菌落数。 转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下： 转化子总数＝菌落数稀释倍数转化反应原液总体积／涂板菌液体积 转化频率（转化子数／每 mg质粒 DNA）＝转化子总数／质粒 DNA加入量 (mg) 感受态细胞总数＝对照组２菌落数稀释倍数菌液总体积／涂板菌液体积 感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数 四，注意事项 本 实验方法也适用于其它 DNA的转化。 但它们的转化效率并不一定一样。 有的转化效率高，需将转化液进行多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板 ,而有的转化效率低 ,涂板时必须将菌液浓缩 (如离心 ),才能较准确的计算转化率。 实验四 RNA的提取和 cDNA合成 一， 概 述 从真核生物的组织或细胞中提取 mRNA,通过酶促反应逆转录合成 cDNA的第一链和第二链 ,将双链 cDNA 和载体连接 ,然后转化扩增 , 即可获得 cDNA 文库 ,构建的 cDNA 文库可用于真核生物基因的结构、表达和调控的分析。 比较 cDNA 和相应基因组 DNA 序列差异可确定内含子存在和了解转录后加工等一系列问题。 总之 cDNA 的合成和克隆已成为当今真核分子生物学的基本手段。 自 70 年代中叶首例 cDNA 克隆问世以来 ,已发展了许多种提高 cDNA 合成效率的方法 ,并大大改进了载体系统，目前 cDNA 合成试剂已商品化。 cDNA 合成及克隆的基本步骤包括用反转录酶合成 cDNA 第一链 ,聚合酶合成 cDNA 第二链 ,加入合成接头以及将双链 DNA 克隆到于适当载体 (噬菌体或质粒 )。 二，材料、设备及试剂 一、材料 水稻叶片或小鼠肝组织。 二、设备 研钵， 冷冻台式高速离心机，低温冰箱，冷冻真空干燥器，紫外检测仪，电泳仪，电泳槽。 三、试剂 无 RNA酶灭菌水：用将高温烘烤的玻璃瓶（ 180℃ 2小时）装蒸馏水，然后加入 %的 DEPC（体积 /体积），处理过夜后高压灭菌。 75%乙醇：用 DEPC处理水配制 75%乙醇，（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。 1层析柱加样缓冲液； 20mmol/L Tris Cl()， ， 1mmol/L EDTA()， % SDS。 洗脱缓冲液： 10mmol/L Tris Cl ()， 1mmol/L EDTA ()， % SDS。 EDTA (50mM和 200mM)， TE饱和酚 :氯仿（ 1:1）， NH4Ac，乙醇 (100%和 70%)，TE缓冲液。 三，操作步骤 （一）动植物总 RNA提取 Trizol法 Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。 用 Trizol法提取的总 RNA绝无蛋白和 DNA污染。 RNA可直接用于 Northern斑点分析， 斑点杂交， Poly(A)+分离，体外翻译， RNase封阻分析和分子克隆。 将组织在液 N中磨成粉末后，再以 50100mg组织加入 1ml Trizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用 Trizol体积的 10%。 研磨液室温放置 5分钟，然后以每 1mlTrizol液加入 ，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管 15秒。 取上层水相于一新的离心管，按每 mlTrizol液加 ，室温放置 10分钟， 12020g离心 10分钟。 弃去上清液，按每 ml Trizol液加入至少 1ml的比例加入 75%乙醇，涡旋混匀， 4℃下 7500g离心 5分钟。 小心弃去上清液，然后室温或真空干燥 510分钟，注意不要干燥过分，否则会降低 RNA的溶解度。 然后将 RNA溶于水中，必要时可 55℃ 60℃水溶 10分钟。 RNA可进行mRNA分离，或贮存于 70%乙醇并保存于 70℃。 [注意 ] 整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。 加氯仿前的匀浆液可在 70℃保存一个月以上， RNA沉淀在 70%乙醇中可在 4℃保存一周， 20℃保存一年。 （二） mRNA提取 由于 mRNA末端含有多 poly(A)+，当总 RNA流径 oligo(dT)纤维素时，在高盐缓冲液作用下， mRNA被特异的吸附在 oligo(dT)纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中， mRNA可被洗下，经过两次 oligo(dT) 纤维素柱，可得到较纯的 mRNA。 用 (dT)纤维素。 将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱中或装入填有经 DEPC处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床体积为 ，用 3倍柱床体积的灭菌水冲洗柱床。 用 1x柱层析加样缓冲液冲洗柱床，直到流出液的 pH值小于。 将（一）中提取的 RNA液于 65℃温育 5分钟后迅速冷却至室温，加入等体积 2x柱层析缓冲液，上样，立即用灭菌试管收集洗出液，当所有 RNA溶液进入柱床后，加入 1倍柱床体积的 1x层析柱加样溶液。 测定每一管的 OD260，当洗出液中 OD为 0时，加入 23倍柱床体积的灭菌洗脱缓冲液， 以 1/3至 1/2柱床体积分管收集洗脱液。 测定 OD260，合并含有 RNA的洗脱组分。 加入 1/10体积的 3M NaAc()， 冰冷乙醇， 混匀， 20℃ 30分钟。 4℃下 12020g离心 15分钟，小心弃去上清液，用 70%乙醇洗 涤沉淀， 4℃下 12020g离心 5分钟。 小心弃去上清液，沉淀空气干燥 10分钟，或真空干燥 10分钟。 用少量水溶解 RNA液，即可用于 cDNA合成（或保存在 70%乙醇中并贮存于 70℃）。 [注意 ] mRNA在 70%乙醇中 70℃可保存一年以上。 oligo(dT)纤维素柱用后可用 ，然后用层析柱加样缓冲液平衡，并加入 %叠氮钠（ NaN3)冰箱 保存，重复使用。 每次用前需用 NaOH水层析柱加样缓冲液依次淋洗柱床。 （三） cDNA第一链合成 (1) 取一灭菌的无 RNA酶的 eppendorf管 ,加入 RNA模板和适当引物 ,每μ g RNA使用 g引物 (如使用 NotⅠ引物接头 ,使用 g),用 H2 O调整体积至 15μ l, 70℃处理 5分钟 ,冷却至室温 ,离心使溶液集中在管底 ,再依次加入 5第一链缓冲液 5μ l rRNasin RNA酶抑制剂 25U MMLV(H )反转录酶 200U H2 O 调至总体积 25μ l (2) 用手指 轻弹管壁 ,吸取 5μ l至另一 eppendorf管，加入 25μ Ci [α 32 P] dCTP (400Ci/mmol),用以第一链同位素掺入放射性活性测定。 (3) 37℃ (随机引物 )或 42℃ (其它引物 )温浴 1小时 (4) 取出置于冰上 (5) 掺入测定的 eppendorf管加入 95μ l 50mM EDTA终止反应 ,并使总体积为 100μ l。 可取 90μ l进行电泳分析 (先用苯酚抽提 ),另 10μ l进行同位素掺入放射性活性测定。 (6) 第一链合成 eppendorf管可直接用于第二链合成 注：以上 25μ l反应总体积中所用 RNA量为 1μ g,如合成 5μ g RNA,则可按比例扩大反应体积 , 倒 5μ g RNA使用 125μ l总体积进行合成。 （四） 第二链合成 取第一链反应液 20μ l, 再依次加入 10第二链缓冲液 20μ l DNA聚合酶Ⅰ 23μ RNase H H2O 加至终体积为 100μ l 轻轻混匀 ,如需进行第二链同位素掺入放射性活性测定 ,可取出 10μ l至另一eppendorf管 ,加入 25μ Ci[α 32 P] dCTP。 14℃温浴 2小时 (如需合成长于 3kb的 cDNA, 则需延长至 34小时 )。 掺入测定 eppendorf管中加入 90μ l 50mM EDTA, 取 10μ l进行同位素掺入放射性测定 ,余下的可进行电泳分析。 cDNA第二链合成离心管反应液 70℃处理 10分钟 , 低速离心后置冰上。 加入 2μ T4 DNA聚合酶 , 37℃温浴 10分钟。 加入 10μ l 200mmol/L EDTA终止反应。 用等体积酚 :氯仿抽提 cDNA反应液 ,离心 2分钟。 水相移至另一 eppendorf管 ,加入 (或 体积的 ,), 混匀后再加入 (20℃ ), 20℃放置 30分钟后离心 5分钟。 小心丢去上清液 ,加入 70%乙醇 ,离心 2分钟。 1 小心移去上清液 ,干燥沉淀。 1 沉淀溶于 1020μ l TE缓冲液。 （五） 电泳分析 通常合成的 cDNA第一链和第二链长度为 3506000碱基 ,需进行 %碱性琼脂糖电泳。 方法见实验二。 实验五 重组质粒的连接、转化及筛选 一， 概 述 在质粒载体上进行克隆 ,从原理上说是很简 单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的 DNA片段 , 然后体外使两者相连接 , 再用所得到重组质粒转化细菌 ,即可完成。 但在实际工作中 , 如何区分插入有外源 DNA的重组质粒和无插入而自身环化的载体分子是较为困难的。 通过调整连接反应中外源 DNA片段和载体 DNA的浓度比例 ,可以将载体的自身环化限制在一定程度之下 ,也可以进一步采取一些特殊的克隆策略 ,如载体去磷酸化等来最大限度的降低载体的自身环化 ,还可以利用遗传学手段如α互补现象等来鉴别重组子和非重组子。 二，材料、设备及试剂 一、 材料 外源 DNA片段 : 自行制备的带限制性末端的 DNA溶液 ,浓度已知。 载体 DNA: pBS质粒 (Ampr ,la。