植物生物技术讲稿

植物生物技术讲稿内容摘要：

在光能抑制未成熟胚的早熟萌发。 22 第二节 胚珠培养 一、胚珠培养的用途 • 成熟胚很小时，胚培养难以成功，采用胚珠培养较易成功。 Maheshwari 将授粉 5 天的罂粟（ Papaver somnierum）胚珠进行离体培养，得到种子。 罂粟授粉 5 天的胚珠仅为合子胚或只有 2 个细胞的原胚。 • 对未 受精的胚珠进行培养可诱发大孢子发育成单倍体植物。 • 在棉花种间杂交中，通过胚珠培养可以防止由于棉铃脱落 丧失杂种胚。 • 研究棉花的纤维发育 二、培养方法 取回花蕾 , 去除苞叶、萼片，将子房消毒，无菌状态下取出胚珠，接种于培养基中。 三、影响胚珠培养成功的因素 培养基的基本组成 （ 1）培养条件 激素 有机成分 （ 2）胚的发育时期 （ 3）胎座和子房 23 第三节 胚乳培养 一、胚乳培养的意义 • 自然条件下，胚乳细胞以淀粉、蛋白质和脂类的形式贮存着大量的营养物质，以供胚胎发育和种子萌发之需。 因此，胚乳是研究这些天然产物代谢过程的一个理想系统。 • 胚乳培养作为通过三倍体而获得产生无籽果实植株的一种手段，倍受国内外果树育种家重视。 • 三倍体在植物产量与品种改良中具有十分重要的意义。 有些具有重要经济价值的植物，苹果、香蕉，桑树、甜菜、茶和西瓜等其三倍体已在生产中得到了利用，并显示出较好的经济效益 • 三倍体植株加倍可产生同源六倍体。 同源六倍体在植 物育种上具有重要的价值。 二、影响胚乳培养的因素 1. 胚乳发育时期 思考题： 1． 进行胚培养、胚珠培养、胚乳培养各有什么意义或用途。 24 2． 胚在离体培养条件有有几种发育途径。 第三章 愈伤组织的诱导、继代和培养 教学时数： 5 学时 教学目的： 要求掌握愈伤组织诱导、继代、培养与分化的基本术语和概念；掌握器官发生与体细胞胚胎发生的区别与联系；掌握促进细胞分化的方法手段。 体细胞再生植株技术的理论与应用价值。 植物细胞全能性 (totipotency)： 植物体细胞或性细胞，在人为控制的培养条件下都具有再生成新个体的潜能，因而在适宜的条件下可以被诱导生长分化形成完整植株。 脱分化 （ dedifferentiation）： 使已分化的体细胞回复到未分化的原始状态并具有细胞全能性表达潜力的过程。 再分化 （ redifferentiation）： 处于脱分化状态的愈伤组织再度分化成类型的细胞、组织、器官，甚至最终再生成完整的植株过程。 第一节 愈伤组织的诱导与继代培养 一、愈伤组织的诱导与培养 1. 外植体的选择 选择外植体要综合考虑以下几个因素 : ①大小要适宜 ,不宜太小。 外植体的组织块要达到 2 万个细胞（ 510mg）以上才容易成活；②同一植物不同部位的外植体，其细胞的分化能力、分化条件及分化类型有相当大的差 25 别；③植物胚与幼龄组织器官比老化组织、器官更容易去分化，产生大量的愈伤组织；④不同物种相同部位的外植体其分化能力可能大不一样。 总之，外植体的选择一般以幼嫩的组织或器官为宜。 用于培养的外植体包括根、茎、叶、果实、子房、花粉、花瓣等各种器官或组织。 2. 外植体材料的准备与消毒 外植体的消毒一般采用次氯酸钠 (市面上售的一般为 1014%有效氯 ),使用时按 1:10稀释 ,消毒时间以材料定 ,消毒后无菌水冲洗 45次。 或用 %升汞消毒。 如果没有特殊的条件要求，在无菌条件下发芽种子能产生无菌的根、茎、叶 (无菌苗 )，较适于诱导愈伤组织。 种子是诱导愈伤组织的很好的起始材料，因为：①可将整粒种子放在加有生长物质的培养基上使其直接产生愈伤组织；②在无激素的培养基上发芽，可产生无菌的根、茎、叶用作外植体；③可直接从种子上剪下根原基及芽尖用作外植体。 3. 愈伤组织诱导 愈伤组织的诱导采用的培养基的基本成分相似，但对于不同植物，同一植物不同物种都要对培养成分作相应改动，尤其是激 素的成分和浓度是极为重要的因素。 生长调节物质之中，特别是生长素，对于细胞分裂的诱导以及在其后的生长和增殖，都是必要的物质。 细胞分裂素未必是必需的物质，然而，常常因不同的供试材料而异。 从单个细胞或外植体上脱分化形成典型的愈伤组织，大致经历三个时期：起动期、分裂期和形成期 : 26 起动期，又称为诱导期 ,是愈伤组织形成的起点。 外植体已分化的活细胞在外源激素的作用下，通过脱分化起动而进入分裂状态，并开始形成愈伤组织。 这时在外观上虽然未见明显变化，但实际上细胞内一些大分子代谢动态已发生明显的改变，细胞正积极为下一步 分裂进行准备。 分裂期。 外植体切口边缘开始膨大，外层细胞通过一分为二的方式进行分裂，从而形成一团具有分生组织状态细胞的过程。 这时组织细胞代谢十分活跃，发生了一系列生理生化及形态的变化。 形成期。 是指外植体的细胞经过诱导、分裂形成了具有无序结构的愈伤组织时期。 这个时期特征是细胞大小不再发生变化，愈伤组织表层的分裂逐渐减慢和停止，接着内部组织细胞开始分裂，细胞数目进一步增加。 二、愈伤组织的继代培养 愈伤组织培养一段时间后必须转移到新鲜培养基上以保持培养物的继续正常生长，更换一次培养基称一代继代培 养 (subculture)。 为什么要进行继代培养。 • 经过诱导培养一段时间后，培养基里的养分耗尽 • 培养基已干燥 • 生长物已充满培养瓶 • 培养物需要扩繁 • 琼脂培养基褐化或发黑 （因为植物组织在培养前几周有时会产生毒素物质，这些物质会扩散进入培养基） • 需要让培养物在一种新的营养条件下生长 27 • 培养基由于植物材料的原因使 pH 降低，导致培养基液化 一般情况下，培养的愈伤组织需要每 4~6 周继代一次。 第一次继代培养时用无菌刀片将新鲜愈伤切下，无菌地转入新鲜培养基上，被转移的愈伤小块 不宜过小，否则生长会受抑制。 一旦愈伤建立起 来，多数愈伤系需要每月继代一次。 继代时一般情况下不需改变原培养基的成分，但很多物种需要将生长素降低些，尤其是使用 2， 4D 时。 第二节 悬浮培养 悬浮培养 (suspension culture)： 一般是把一些小块生长旺盛的愈伤组织放入液体培养基中，进行振荡培养，从而使愈伤组织块变成良好分散性的细胞和小的细胞聚集体。 愈伤组织通过悬浮培养能产生大量的比较均一的细胞，而且细胞增殖速度快，适宜进行大规模细胞的培养。 一、悬浮培养的用途 • 提供一个相对一致的细胞群体（供生化研究、胚胎发生研究、胚的同步化研究等 ） • 能快速吸收外源物质，检查药效 • 研究次生代谢、酶诱导、基因表达、抗生素的降解的良好实验体系 • 多数悬浮细胞缺乏叶绿体、色素，对酶和次生物质的分离及纯化十分有利 • 细胞增殖速度快，适于进行大规模培养 • 分离原生质体的良好细胞来源 28 二、从愈伤组织建立悬浮培养体系 多数悬浮培养物（ suspension cultures）是将生长快、质地疏松的愈伤小块转移到与愈伤诱导含同样成分的液体培养基里进行振荡培养而获得。 接种时必须有足够多的细胞块，以保证有较合适的细胞密度。 振荡速度一般为 30150rpm。 第一次继 代时，应去掉开始时接入的大块细胞团 ——过滤。 有时有些物种的愈伤块很坚硬，接入液体培养基后不能分散，继代几次就会长出疏松愈伤。 三、悬浮培养物的继代和生长情况检测 比固体培养继代时间短得多，一般每周或每两周继代一次。 其方法是：培养瓶静置一段时间后，用吸管吸去上清液，加入新鲜培养液。 如果培养物过多，需要分瓶。 悬浮培养物的生长情况检测可以通过下列参数确定： • 细胞叠积体积（ packed cell volume， PCV） • 细胞数（ cell number） • 鲜、干重（ wet and dry weight） • 蛋白质和 /或 DNA 含量（ protein and/or DNA content） • 培养基电导率（ medium conductivity） • 细胞生活力（ cell viability） 29 第三节 愈伤组织分化与植株再生 体细胞胚胎发生： 指从体细胞进行的类胚结构的生产。 体细胞胚是一个二极结构，不物理地附着于原组织，每一个体细胞胚称为胚状体，它可以同合子胚一样发育成植株。 器官发生： 指从愈伤组织形成芽及根的过程，芽是一个单极性结构，物理地同母体组织联结着。 一、 器官发生与植株再生 1. 器官发生与 植株再生的方式 在适合的激素浓度和配比及温光条件下，愈伤组织细胞会发生生理代谢上的改变，促使细胞分裂部位和方向改变，首先出现分生细胞，经细胞分裂逐渐形成分生细胞团和分生组织，进一步再分化形成维管结节直至分化成芽和根等器官。 可以把愈伤组织分化出芽、根器官概括为以下几种方式 ⑴单极分化：愈伤组织中的分生中心在刺激物质的影响下向着一极分化，形成有根无芽或者有芽无根的现象。 ⑵双极分化：愈伤组织中随着细胞分裂出现两个或两个以上分生中心，其中有的分化芽，有的分化根，根芽之间并无输导等组织沟通，在培 养瓶内靠愈伤组织提供养料，这种以愈伤组织隔离着的芽和根的苗，常常不能移栽成活。 ⑶先芽后根：愈伤组织中产生多个分生细胞形成分生中心，从中仅分化出芽，一般情况下待芽长到一定大小时，切下移入生根培养基中，在其基部 30 即可分化出根。 有些植物在分化芽的培养基上同时在芽器官基部分化出根，形成完整的植株。 大多数植物均属这类正常的分化途径，这类苗移栽较易成活。 ⑷先根后芽：有些植物外植体脱分化后在愈伤组织上先分化出根，而后在靠近愈伤组织的根部上再分化出芽，有的将根切下放入分化培养基，再于根上分化出芽器官，甚至在根端也能分化出 芽。 2. 影响器官发生的因素 • 化学因素 : 从早期烟草组织的研究我们知道 ,器官发生的表达可被外源化学物质控制 ,高浓度的生长素和低浓度的分裂素可以促使细胞连续繁殖 ——无组织的生长。 相反，高浓度的分裂素能引起茎 芽（ shootbud）形成。 同时，auxion/cytokinin 之比值的变化成为特定的器官、根或芽分化的一个参数，一个基本的规律是：生长素促进根分化，分裂素促进芽分化。 生长素与根形成有关，同时对于愈伤组织的保持也是必须的。 在促进芽的分化中， BAP是最有效的。 • 物理因素 光：很多光 照条件下，一些植物均能进行器官发生，说明光周期并不是非常重要的因子，可有的植物在光、暗交替条件下才能形成芽，而在连续光照下则不能。 尽管如此，多数植物需要一个稳定的光周期，多数培养条件是 1416h 光照， 810h 黑暗。 光质对于某些植物可能也很重要。 温度：不同植物不一样，需要摸索，如烟草和棉花就不一样。 31 第四节 体细胞胚胎发生与植株再生 在离体组织细胞培养形成胚状体的过程中，体细胞分裂增殖并顺序通过原胚期，球形胚期，心形胚期，鱼雷形胚期和子叶期五个时期，进而形成完整的植株，与整体植物中受精卵的发 育过程极为相似。 一、植物胚状体发生的普遍性 由于培养的植物组织细胞一般是体细胞，因而将由离体培养的组织细胞分化出的胚叫体细胞胚 (somatic embryo)；又由于离体培养的植物组织细胞是在未经过有性过程的情况下直接产生胚这一结构，并且形成的胚与性细胞形成的胚相似，因此也将此类胚称为胚状体（ embryoid）。 胚状体发生在高等植物中是一个普遍现象，既包括双子叶植物，也包括单子叶植物；既包括许多草本植物，也包括许多木本植物。 产生胚状体的离体培养物也是多种多样的，离体的根、茎、叶、花芽、花药、 幼苗、子叶、子房中的合子胚、胚状体、多种单细胞、游离的小孢子以及原生质体，都曾记录过有直接或间接（ via callus）产生胚状体的能力。 二、研究胚状体的意义 • 数量多。 在细胞、愈伤组织和器官的培养中，一个培养物上诱导胚状体的数量，往往比诱导芽的数量要多得多。 • 速度快。 胚状体是从单细胞直接分化成小植株，而其它再生植株的方式，一般要经过愈伤组织阶段，时间上要慢得多。 32 • 结构完整。 胚状体一旦形成即可长成为小植株，成苗率高。 • 是研究胚发育的良好材料体系。 • 用于人工种子研究与生产，可节约大量种子，且可固定杂种优势。 三、胚状体的概念与分类 胚状体是植物组织培养中起源于非合子细胞，经过胚胎发生和胚胎发育过程形成的胚状结构。 这个定义包括下列几点含义：① 胚状体是组织培养的产物，只限于组织培养范围使用，区别于无融合生殖的胚；② 胚状体起源于非合子细胞，区别于合子胚；③ 胚状体的形成经历胚胎发育的过程，区别于组织培养中分化的芽体。 胚状体可按其来源分为两大类：一类。