第十章基因工程药物

第十章基因工程药物内容摘要：

度高时，分子末端数也高，连接几率增加，反应产物的产量随之上升； DNA 分子浓度也影响反应体系中的产物构型。 通常在两种构型产生：①线性 DNA 分子，不同 DNA 分子之间首尾相连形成线状结构；②环状 DNA 连接物，同一分子的两个末端或多个分子首尾连接形成的线性分子的两端 发生连接反应，形成环化分子。 重组 DNA 分子的构型对后续的转化过程有显著的影响，例如用λ噬菌体载体构建的重组子在线性结构时，更适用于包装成成熟的病毒颗粒而有效地转染细胞，而质粒载体则应形成环状结构才有利于转化细菌。 二、重组子导入宿主细胞 带有外源 DNA 片段的重组体分子在体外构成之后，需要导入适当的寄主细胞进行繁殖，才能够获得大量的纯一的重组体 DNA 分子。 这样一种过程习惯上叫做基因的扩增（ amplification）。 由此可知，选定的寄主细胞必须具备使外源DNA 进行复制的能力，而且还应该能够表达导入的重组体分 子所提供的某种表型特征，这样才有利于转化子细胞的原则与鉴定。 将外源重组体分子导入受体细胞的途径，包括转化（或转染）转导、显微注射和电穿孔等多种不同的方式。 转化和转导主要适应于细菌一类的原核细胞和酵母这样的低等真核细胞，而显微注射和电穿孔则主要应用于高等动植物的真核细胞 三、阳性重组子的筛选和鉴定 在 DNA 重组完成并转化了相应的宿主细胞以后，必须对其进行筛选和鉴定。 这是由于选用的载体、宿主细胞的差异所决定的，同时在转化过程中，常出现多种结果，例如非重组子转化、野生载体转化、外源基因多拷贝转化等结果。 这些均与 阳性重组子的转化不易区分，因此需要根据不同的载体、宿主及外源 DNA的性质，选用不同的筛选和鉴定方法。 四、克隆基因的表达 基因表达是基因工程中的主要内容，包括目的基因的转录、翻译以及蛋白质产物的加工等内容。 因此将某一目的基因克隆后，再将其导入到适宜的表达系统中，才能获得相应的蛋白产物。 而基因表达系统包括载体和相应的宿主细胞两部分。 目前，基因工程中将载体分为克隆载体和表达载体。 在克隆载体中通常仅带有一个松弛型复制子、一个多克隆位点和一个筛选标记，以便被克隆和筛选的DNA 序列能够大量增殖。 而表达载体除了上述因子 外，还需要有强启动子、核糖体结合位点、转录起始信号、转录终止信号、翻译起始密码子和终止密码子等一系列调控序列。 在基因工程中除了选择合适的载体以外，还要选用相应的宿主细胞，一起组成表达系统。 常用的表达系统主要有原核和真核表达系统。 原核表达系统主要有：大肠杆菌系统和枯草杆菌系统等。 真核表达系统主要有：酵母细胞系统、哺乳动物细胞系统、昆虫细胞 (杆状病毒 )系统和高等植物系统等。 下面主要介绍利用大肠杆菌细胞表达外源基因的原核系统和在酵母菌中表达外源基因的真核系统。 大肠杆菌作为表达宿主 1977 年，研究者第一次成 功地在大肠杆菌中表达了人类生长激素释放抑制因子，此后，大量的真核生物基因在此系统中得到表达。 这些细菌没有真核生物所具有的翻译后的修饰作用，因此该系统特别适用于没有修饰或只有有限修饰的蛋白质的合成。 该表达系统处理容易，使用安全，虽不能将蛋白质加工成熟完全，但也成为这些蛋白质的重要表达宿主。 许多基因重组蛋白产物都已在大肠杆菌中成功表达，如生长激素、胰岛素、干扰素和白介素 2，这些蛋白在体内都是分泌型的蛋白质，因此在分泌过程中可发生有限的翻译后修饰，如肽键的断裂、二硫键的形成等。 在以大肠杆菌表达时，为获得正确形式的 蛋白质，许多有创意的方法被设计出来，必要时还可在体外进行最后的修饰。 为得到高水平表达，人们致力于研究在表达载体中插入适当片段的方法。 有人采用高转录效率的细菌基因启动子，通过组合型启动子或改变生长环境 (温度、化学物质等 )的方法可使调控型启动子开启或关闭。 例如来自于乳糖操纵子 噬菌体启动子 PR 的 lac 启动子，其优点是：只有当相对密度达到一定的水平时，重组蛋白质的合成才开始，且在很短的蛋白质合成期间就能产生足够所需量的蛋白。 酵母菌作为表达宿主 酵母菌是主要以单细胞生存的真菌，作为真核生物酵母 菌能在人体内进行翻译后修饰，这点对中等复杂度的蛋白质和多肽的生产是很有用的，但非常复杂的蛋白质要在更高级的有机体内表达。 食品生产中一直采用酵母为工具，这为将其应用于蛋白质药物的生产提供了方便。 许多生物学家认为，现在使用的酿酒用酵母 (面包酵母 )是一个较好的表达系统，并已经在基因水平和分子水平上进行了广泛的研究。 将来，其他的酵母类型如 Pichia pastoris、 Hansenula Polymorph 和Yarrowia lipolytica 也许都会用于药物生产。 迄今为止，只有 (啤酒酵母 )生产出的药物已用于人体，如胰岛素和乙型肝炎疫苗。 像大肠杆菌一样， 也含有自然质粒 (2μ m 质粒 )，连上选择性标记后可作为载体。 含有突变的酵母基因经常用于质粒的选择，而不采用抗性基因标记，这一方法也可用于大规模抗生素的筛选。 作为真核生物，酵母细胞有分泌通道，这一通道很像哺乳动物细胞的分泌过程，它经常用于分泌型重组蛋白质的生产，原因有两点：①分泌型蛋白翻译后的修饰在分泌过程中进行；②易于纯化。 但是在分泌过程中常常会出现一些不太令人满意的情况，例如 N连接、 O— 连接、糖基化修饰的 缺失、糖基化侧链的形成等在酵母与人细胞中不同。 酵母产生的糖蛋白对人有免疫源性，因而糖蛋白不适合在酵母中生产。 五、基因表达产物的检测 一种克隆的外源基因，是否能够在新宿主细胞中有效地表达，需要通过一定的实验才能作出正确的判断。 如果我们事先已经知道克隆基因编码的蛋白质或RNA 组成，就能够据此设计出适当的实验，检测基因在新宿主中的表达情况。 例如，化学合成的激素和胰岛素基因，可用敏感的放射免疫测定法检测； 5S RNA可用适当的探针进行杂交检测，对于某些酶产物，可以通过同适当的营养缺陷突变型宿主间的互补作用予以检测。 目前，检测基因表达的方法以及分析被检测基因在细胞中转录和翻译的情况有下列方法； Northern 杂交 检测细胞中是否含有特定的 mRNA，测定特定 mRNA 在总 RNA 中的比例，由此获得目的 mRNA 的转录情况。 斑点杂交 用特异性探针检查 mRNA，并估计表达过程中 mRNA 的转录强度。 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 分析诱导前后细胞中目的蛋白质的表达水平。 如表达水平很低，可用同位素作为放射性标记，如 35 S甲硫氨酸或 35S半胱氨酸进行代谢标记，然后进行 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影，或在 We stern 杂交中用特异性单克隆抗体或多克隆抗体分析目的蛋白质存在与否及其含量。 免疫学方法 利用特异性抗体与目的蛋白质进行反应，经免疫沉淀、 ELISA 等免疫学方法，检测表达蛋白质。 例如，免疫沉淀法可用于检测并定量分析多种蛋白质混合物中的靶抗原。 这种方法很敏感，可检测出 100pg 的放射性标记蛋白质。 当与 SDS— 聚丙烯酰胺凝胶电泳并用时，即可用于分析外源基因在原核和真核宿主细胞中的表达情况。 放射性标记靶蛋白的免疫沉淀以及其后的分析包括下列几个步骤：①靶蛋白的放射性标记；②裂解细胞，③特异性免疫复合物的形成； ④免疫复合物的收集及纯化；⑤放射性标记蛋白质的免疫沉淀分析。 第三节 基因工程技术在药物研究中的应用 一、细胞膜受体作为药物研究的靶点 药物的基本作用部位是酶、受体、离子通道和活性转移复合物，这些作用部位都是蛋白质，它们能通过克隆或相关基因表达的方法而得到，这一点对于非肽类药物的研究和发展有深远的影。