结核病防治规划痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册10-22-2新版eqa

结核病防治规划痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册10-22-2新版eqa内容摘要：

染色特征的细菌习惯上被称为抗酸菌 (acidfast bacillus, AFB)。 目前，除结核分枝杆菌以外 (临床上最常见的分枝杆菌 )，发现的分枝杆菌种类已达 100 余种。 当然，除分枝杆菌属的细菌以外，还有少数细菌具有抗酸染色特征，但抗酸性较弱。 萋尼氏 (ZN)染色法基本原理是：抗酸菌具有耐受酸性介质脱色的生物性状。 此类细菌在石炭酸（苯酚）的协同作用下，被复红染色剂着色，能够耐受酸性酒精脱色，显微镜观察 时保持红色；而其它脱落细胞或标本中的非抗酸菌被酸性酒精脱色后，可被复染剂亚甲兰染为蓝色。 AFB抗酸染色特性还与菌体细胞结构的完整性有着密切联系。 当患者标本直接进行涂片镜检时，能够发现分枝杆菌形态变化较多。 结核分枝杆菌多数为杆状、稍弯曲；菌体宽度 ～ ；菌体长度不一，在 ～8um 之间，多数在 ～ ；少数菌体较长者可呈螺旋状；染色良好的结核分枝杆菌菌体内，能够发现着色较深的异染颗粒。 含结核分枝杆菌较多的新鲜标本经萋尼氏染色， 100油镜观察，既能发现单个存在的细菌、也能看到聚集成簇或分枝状排列的细菌。 (二 ) 荧光染色显微镜检查法 ： 同萋－尼染色显微镜检查法。 （ 1） 玻片经火焰固定后，滴加染色剂盖满玻片，染色 30 分钟；流水自玻片一端轻缓冲洗，洗去染色液，沥去玻片上剩余的水。 （ 2） 痰膜上端外缘滴加脱色剂， 盖满玻片 ． ． ． ． ，脱色 3分钟或至无色，流水自玻片一端轻洗，洗去脱色剂。 （ 3） 加复染剂复染 1 分钟，沥去复染液，流水自玻片一端轻洗，自然干燥后镜检。 （ 4） 染色液配制方法详见附件 3。 玻片放置在玻片台上并以卡尺固定后，首先以 10目镜、 20物镜进行镜检，发现疑为 AFB的荧光杆状 物质，使用 40物镜确认。 在暗背景下，抗酸菌发出黄色荧光，呈杆状略弯曲。 ： （ 1） 结果分级报告标准： 荧光染色抗酸杆菌阴性 ()： 0条 /50视野； 荧光染色抗酸杆菌阳性 (报告抗酸菌数 )： 1～ 9条 /50 视野； 荧光染色抗酸杆菌阳性 (1+)： 10～ 49条 /50 视野； 荧光染色抗酸杆菌阳性 (2+)： 1～ 9 条抗酸菌 /1视野； 荧光染色抗酸杆菌阳性 (3+)： 10～ 99条抗酸菌 /1 视野； 荧光染色抗酸杆菌阳性 (4+)： 100 条及以上抗酸菌 /1 视野。 （ 2） 、报告 2＋至少观察 50个视野， 3+及以上 的阳性结果至少观察 20个视野。 (三 ) 玻片的保存 萋尼氏染色玻片阅读完毕后，应及时用擦镜纸轻轻在涂片上揭取数次，彻底去除玻片上的镜油。 经脱油、干燥后的玻片，按实验室序号及涂片编号放置在玻片盒中，存放在阴凉干燥的环境中避光保存，以备复检或质控抽检。 荧光染色的玻片，玻片盒中放置干燥剂后密封放置在 4℃ 冰箱避光保存。 荧光染色的涂片进行盲法复检复核时，应首先将复检涂片脱色后进行萋尼氏染色后，重新阅读。 四、抗酸菌痰检注意事项 （一）涂片染色镜检制备注意事项 1. 一张载玻片上只能涂抹一份痰标本。 2. 每张载玻片只能使用一 次，不得清洗后再次用于 AFB 涂片检查。 3. 涂抹后的痰膜不能太厚或者太薄，透过痰膜看报纸上的 5号字时，字迹较模糊为适宜的厚度；看不见 5号字或很清晰，则表明该玻片涂抹过厚或过薄。 4. 由于香柏油 (cedarwood oil)能够溶解复红染料，使萋尼氏染色褪色，并且容易干燥凝结，对油镜头造成损害；故禁止使用香柏油，必需使用显微镜专用的镜油（英文名： Immersion oil, for microscopy）。 镜油折射系数（ RI）应大于 ， 20℃黏度系数应在 100120mPas之间。 5. 采用荧光染色法镜检 AFB，只限 于那些工作量较大 (每人日读片数超过 25张 )、具备荧光显微镜、且镜检人员接受过荧光染色镜检培训的实验室开展。 6. 采用荧光染色时，荧光随着时间而衰减。 故荧光染色后的涂片应于当日镜检；如果玻片数量过多，应将涂片放置于 4℃避光保存，次日必须完成镜检。 （二） AFB痰检假阳性结果的预防措施 1． 必须使用新玻片进行涂片检查。 2． 每个标本均使用一个新竹签完成制片涂抹。 3． 所有染液均经过滤。 4． 染色时玻片彼此保持一定距离，相互彻底分隔开。 5． 严禁使用染色缸染色。 6． 染色时勿使玻片上的染液干燥。 7． 滴加染色液或镜油时，避免容器滴口直接接触痰膜。 8． 严禁物镜镜头直接接触痰膜。 9． 作为对照，可采用已知结果为阴性的玻片完成染色镜检过程。 10． 完整、准确的标注痰盒、玻片和登记实验登记本。 11． 登记前、后对检验单和标本盒上的标注进行仔细核对。 12． 准确记录和报告结果。 （三） AFB痰检假阴性结果的预防措施 确认标本是痰而非唾液。 确认每份标本至少有 3ml。 选择脓样、干酪样、粘液分泌物涂抹制备玻片。 制备玻片时标本涂抹均匀，不要太厚或太薄。 使用高质量染料、严格按照配方配制染液。 严格按照操作程序完成染色过程。 判断结果为“阴性”前，必须阅读 规定要求的视野数。 作为对照，可采用已知结果为阳性的玻片，完成染色 镜检过程。 完整、准确的标注痰盒、玻片和实验登记本。 登记前对检验单和标本盒上的标注进行仔细核对。 1准确记录和报告结果。 第五节显微镜的使用、维护和保养 显微镜作为结核病防治工作中的重要设备，实验室工作人员应正确使用并给予日常维护，以保证其正常工作和延长使用寿命。 在使用和维护显微镜时应特别遵守下列要点： 一、一般原则 （一）显微镜是精密仪器，所以应注意 小心操作，避免任何撞击。 移动显微镜使用双手，一手托于显微镜 底部，一手握显微镜臂。 不要自行拆开显微镜。 不要将可拆卸的目镜或其他光学部件摔落。 避免振动、过热、日光直射、潮湿以及灰尘。 （二）如有灰尘或有溅出的镜油弄脏显微镜，应立即清理 清洁显微镜表面：用柔软的纱布沾少量中性清洁剂清洁。 清洁目镜内部的镜头或聚光器：用镜头纸或柔软的干布擦拭。 （这些镜头经常是用光学塑料做成，溶剂可能会使镜头变得模糊）。 清洁物镜：使用镜头纸或柔软的干布清洁（使用溶剂可能会使粘附镜片的胶溶解）。 只有当清洁诸如目镜外部镜头等玻璃部件时，可以用柔软的纱布沾取少量溶剂（乙醚与 乙醇的混合物，体积比为 8： 2或 7： 3）擦拭。 必须注意：目前光学塑料被用于越来越 多的部件中，所以在显微镜的清洁中不使用溶剂是最安全 的。 应该特别注意灰尘，可以用橡皮吸球轻轻吹掉，也可以使用柔软的刷子清洁。 （三）在潮热地区，可能会生长霉菌，破坏显微镜的光学部件。 为了避免霉菌生长，可以将显微镜罩好，再将其放在用 1－ 2个 40瓦灯泡加热的柜橱内或放置在空气流通处。 在这样的地区，显微镜不能放在木箱中过夜。 近来某些品牌的显微镜附带抗真菌装置，安装在显微镜的内部。 （四）为避免划痕或留下纤维，只能使用镜头纸或软布清洁光学 部分，而不能使用普通纸巾或棉花。 （五）显微镜只能由接受过专门培训的技术人员拆卸。 不能常规地打开显微镜进行清洁，除去目镜清洁镜头足以使灰尘和真菌的孢子穿透并附着在棱镜上。 同样地，如果移去物镜头进行修理或更换，应该用显微镜厂家提供的塑料塞封住物镜转换器上的孔洞。 二、日常维护 安稳水平放置显微镜。 除去表面的灰尘。 检查显微镜上的灰尘和油渍，如果需要，按上述方法清洁。 检查物镜是否擦拭（有的人可能会将显微镜的物镜浸到镜油）。 使用后应关闭显微镜电源（适用于电光源的显微镜）。 待显微镜灯 泡及其周围部分充分冷却后拔除电源线。 盖好显微镜并存放好。 三、维修和保养 如上所述，只有经过专门培训的技术人员才可以进行显微镜的维修和超出上述范围以外的保养。 未经专门培训的人员所能进行的唯一“维修”操作是更换破损的灯泡： 更换灯泡前，关闭显微镜电源，待显微镜灯泡及其周围部分充分冷却后拔除电源线。 如果必须倒转显微镜以触到灯泡部分，应先拔下目镜头，否则目镜可能掉落。 确认你选择了正确的灯泡：查看显微镜说明书中的详细说明。 正确更换新灯泡：现在许多显微镜装有卤素灯泡（很小但是功率很强）。 这些卤素灯泡会变得很热，因此一定不要用手触摸，因为在灯泡的工作温度下，即使很少的油脂也会和玻璃起反应，并使灯泡破损。 所以，当更换卤素灯泡 时，要使其一直在塑料袋中进行操作，当灯泡安装到位后才能除去塑料袋。 如果这样的灯泡被手指接触，或经其他途径被弄脏，应使用纱布浸少许酒精擦拭，并在干燥后安装。 打开灯泡小室的盖子。 安装新灯泡（如果是卤素灯泡可将灯泡插脚插入针孔，或者将其他灯泡旋转入位）。 关闭灯泡小室的盖子。 插上显微镜电源试用。 第六节试剂和材料 为保障痰涂片镜检工作的连续性，各实验室应根据 实际工作负荷储存一定数量的实验耗材和相应试剂，储备量一般应比平均工作量高 20％作为缓冲。 每检查 1000 份标本所试剂消耗和应该储备的耗材和试剂见表 1： 表 1 实验室准备耗材 (每检查 1000 份标本 ) 材料、试剂名称 实际用量 需要储备量 备注 痰盒 1000 个 1200 个 竹签 1000 个 1200 个 载玻片 1000 张 1200 张 镜油 100 ml 120 ml 复红染色液 3000 ml 3600 ml 每张玻片需染色液、复染液各约 3ml，需脱色液约 6ml； 亚甲兰复染液 3000 ml 3600 ml 浓盐酸  300 ml 360 ml 95%酒精  5700 ml 7000 ml 石碳酸 135 g 162 g 金胺 O 染色液 (如使用荧光染色 ) 3000 ml 3600 ml 高锰酸钾复染液 (如使用荧光染色 ) 3000 ml 3600 ml 定性滤纸 6 张 擦镜纸 2 本 玻片盒 (100 张 /盒 ) 10 个  盐酸、酒精的消耗量根据脱色情况调整。 第三章痰涂片显微镜检查质量保证 实施质量保证工作对于持续提高结核病实验室痰涂片检查的工 作效率和可靠性非常重要。 质量保证 (Quality Assurance, QA)包括三个方面： 室内质量控制 (Quality Control， QC)、 室间质量评估（ External Quality Assessment, EQA）、质量提高（ Quality Improvement, QI）。 按照 国家结核病防治规划 的要求以及 WHO的建议，在实验室内部质量控制的基础上，应用实验室间质量检查和评估的方法，进行实验室检查系统的评价，并通过采取一系列措施不断改进和提高实验室服务的总体水平。 必须依靠全国结核病实验室质量保 证系统网络。 现将我国结核病实验室网络及职能、质量保证工作介绍如下。 第一节实验室网络及职能 实验室质量保证依赖于完整的实验室网络以及网络中各级实验室是否能够有效地发挥各自职能。 一、 结核病实验室网络 图４ 结核病实验室网络 二、质量保证体系中各级实验室职能 （一）国家结核病参比实验室 根据国家结核病防制规划的要求，组织全国结核病实验室的工作，制定和推行结核病细菌学实验技术标准化准操作规程及规章制度。 建立可行的全国结核病实验室质量控制标准和质量保证系统，并负责组织、实施。 指导、协调、检查各省 （市、自治区）结核病实验室工作，为全国各级结核病实验室服务提供技术支持。 对结核病实验室的设施、设备、耗材的技术指标及质量进行评价。 参与跨国参比实验室的质量评估。 （二）省（市、自治区）级结核病参比实验室 按照国家和省结核病防制规划的要求，在国家参比实验室的统一部署下，规划本省结核病实验室工作，制定实施措施，协调、指导省内各级结核病实验室工作并提供技术支持。 根据国家结核病实验室质量保证体系的要求，组织全省各级实验室痰涂片镜检的质量保证工作，按要求对所辖的地市、县级实验室进行督导和评估，指 导地市级实验室对各县级实验室的盲法复检和现场评估。 对本省结核病实验室所用耗材、试剂的质量进行评估和核准。 建议省级参比室为全省统一提供抗酸染色试剂，为省内开展分离培养的实验室统一提供培养基。 负责组织、实施本省结核病实验室质量保证相关的培训工作。 接受国家参比实验室的质量评估，按有关规定上报各类表格。 （三）地（市）级结核病实验室 在省级参比实验室的指导下，制定本地（市）结核病实验室工作计划。 根据国家结核病实验室质量保证体系的要求，组织实施本地市痰涂片镜检的盲法复检和现场评估，并按要求 向省参比实验室报告结果。 对县级实验室以及乡镇卫生院查痰点提供技术支持。 在省级参比室难以统一提供抗酸染色试剂时，协助省级为辖区内的痰涂片检查实验室提供抗酸染色液。 培训所辖县（市）结核病实验室技术人员，监督辖区内检验人员培训后上岗制度。 接受省级参比室的质量控制、技术培训和现场督导。